第五章 分子生物学研究方法-DNA序列分析

1、西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院第五节 DNA核酸序列分析返回目录返回第二章西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院目的与要求目的与要求掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。重点：重点： Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法双脱氧链终止法策序原理和方法难点：难点：如何根据凝胶电泳直接读出如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列序列学时：学时：2学时学时学习方法：学习方法：课堂讲授与讨论相结合课堂讲授与讨论相结合西

2、北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.3.1 Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 2.3.2 MaxamGilbert化学修饰法化学修饰法 2.3.3 序列分析自动化序列分析自动化2.3.4 杂交测序杂交测序2.3.5 DNA策序的商业运作及存在问题策序的商业运作及存在问题2.3.6 思考问题思考问题西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.1 Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研年代末

3、就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡如何分离寡核苷酸片段核苷酸片段；另一方面，在；另一方面，在研究思路研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。缚。1965，Cornall大学以大学以SWHolle，为首的科学家小组，首次完成为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种的全序列测定。即利用各种RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。降解成寡核苷

4、酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（DrRay Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；MSmith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。引物引物延伸测序策略延

5、伸测序策略西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院q反应：反应：同时加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一种种ddNTP、以及以及 四种四种dNTP（有一

6、种带放射性标记）。q变性胶电泳变性胶电泳分离反应混合物。q放射自显影术放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。q结果判读结果判读，从放射性X光 底 片 上 ， 直 接 读 出DNA的核酸顺序。反应混合物中，标记什么最方便？反应混合物中，标记什么最方便？西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院GTACGTTGACGCCddATP ddTTPddGTP ddCTPddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC考考你考考你西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的

7、主要方法-生命科学院生命科学院酶、原料比例在实际的DNA合成反应中，使用失去了5 3核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。dNTPddNTP=1：100时，谱带分离效果较佳，可读出多于 200个以上的核苷酸顺序。降低ddNTP对dNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。dNTPddNTP与良好的电泳谱带模式的关系如何？与良好的电泳谱带模式的关系如何？西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的

8、主要方法-生命科学院生命科学院2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分析分析：这样处理后，能：这样处理后，能策得高分子量策得高分子量DNA吗？吗？为了将这些降解的为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序片段，按其原来的顺序“拼排拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？实际上可行吗？高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消

9、化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。片段，供进一步分析。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院这些供作序列测定的这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅片段绝大多数都仅为数百个核酸为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。片段。费时费钱费时费钱，因，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十

10、分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。的损伤和丢失。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院克服缺点的一种途径DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌

11、体，例如噬菌体，例如 M13作为作为载体，重组体噬菌体的载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交区段杂交。称做。称做“通用引物通用引物” 。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院M13载体克隆DNA片段将将DNA片段克隆在片

12、段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于载体特定位点上，即位于 Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。内。重组体噬菌体，在含有重组体噬菌体，在含有IPTG和和Xgal的培养基平板上形成的培养基平板上形成白色白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色蓝色的噬菌斑。的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研

13、究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院使用M13载体系列的优点所有的待测定的所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。和分离各种不同引物的许多麻烦。最初使用的引物，是克隆在最初使用的引物，是克隆在PBR322质粒载体上的一种短的限制片段。以质粒载体上的一种短的限制片段。以后后J

14、Messing等人（等人（1981）发展出了一种更加适用的长度为）发展出了一种更加适用的长度为15bp的合成的合成引物，这段引物同引物，这段引物同M13的其它位点之间有的其它位点之间有低度的同源性低度的同源性，后来又合成出，后来又合成出了改进的同了改进的同M13其它任何位点其它任何位点均无同源性均无同源性的引物。的引物。现在，应用现在，应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采最普遍采用的快速用的快速的的DNA序列分析法。序列分析法。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命

15、科学院2.5.1.3 Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法自引入M13载体系列，DNA序列分析又有了新的改良和发展。起初起初是使用Klenow片段，现在现在则可以使用反转录酶或T7DNA聚合酶。以往以往都是把待测DNA片段克隆到M13mp载体上，得到单链模板后，再按双脱氧链终止法进行序列分析。现在现在，可以将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析

16、法。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法基本步骤待测待测DNA与与pBR322或或pUC分子分子重组重组；转化转化：转化反应物涂布在补加：转化反应物涂布在补加有有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，选择性培养基平板上，经经37过夜培养；过夜培养；挑选白色菌落，挑选白色菌落，制备质粒制备质粒NA。碱变性处理碱变性处理，与引物一起退火，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。然后按双脱氧法作序列分析。优点优点：无需将：无需将DNA克隆到克隆到M13载载体上，更为简单快速，

17、现已被许体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。多研究工作者采用。返回目录返回目录西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.2 MaxamGilbert化学修饰法是是1977年由美国哈佛大学的年由美国哈佛大学的AMMaxam和和W Gilbert 发发明的，所以又叫做明的，所以又叫做MaxamGilbert DNA序列分析法序列分析法虽然说对于大分子量的虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，化学修饰片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，法并不如双脱氧法方便有效，其

18、发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。返回目录返回目录西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.2.1 Maxam Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理化学试剂处理末端标记末端标记DNA片段片段，碱基的特异性切割碱基的特异性切割产生的产生的DNA片段混合物片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学

19、研究的主要方法-生命科学院生命科学院出发材料出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端末端带有放射性标记的DNA片段 (双链或单链）关键：关键：4种核苷酸碱基中，有12种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院碱基特异的化学切割反应肼专用试剂有专用试剂有硫酸二甲脂硫酸二甲脂和和肼肼。肼肼又叫做又

20、叫做联氨联氨（NH2NH2），），在碱性的条在碱性的条件下，它能够从件下，它能够从 C4和或和或 C6原子位置作原子位置作用于用于T和和C两种碱基，并用两种碱基，并用 C4-C5-C6环化环化形成一种新的形成一种新的 5原子环。联氨的进一步作原子环。联氨的进一步作用释放出吡唑琳酮环用释放出吡唑琳酮环，留下的嘧啶碱基的留下的嘧啶碱基的N1C2N3片段则仍然连接在糖环上。片段则仍然连接在糖环上。在具有在具有六氢吡啶六氢吡啶的条件下，通过的条件下，通过-消除反消除反应应，2个磷酸分子便会从糖片段上释放出个磷酸分子便会从糖片段上释放出来，从而导致在这个核苷酸位置上发生来，从而导致在这个核苷酸位置上发生

21、DNA链的断裂。链的断裂。反应体系中加入反应体系中加入lmol/L浓度的盐，浓度的盐，肼肼同同T的反应速率便会逐渐下降，以确保发生的反应速率便会逐渐下降，以确保发生C特异的化学切割反应。根据这一特点区别特异的化学切割反应。根据这一特点区别C和和C+T之间的降解产物。之间的降解产物。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院硫酸二甲酯（CH3O）2SO2在在硫酸二甲酯硫酸二甲酯的作用下，的作用下，DNA碱基环碱基环中的氮原子发生中的氮原子发生甲基化反应甲基化反应（G N7原原子和子和A N3原子）。原子）。中性中性PH，甲基化

22、导致配糖键，甲基化导致配糖键水解水解，留，留下失去碱基的糖片段作为糖一磷酸骨下失去碱基的糖片段作为糖一磷酸骨架上的键。这种键十分微弱，易于通架上的键。这种键十分微弱，易于通过碱催化的消除反应使围绕在糖片段过碱催化的消除反应使围绕在糖片段两翼的两翼的磷酸脱落，造成磷酸脱落，造成DNA断裂断裂。由。由于于A N3原子的甲基化比原子的甲基化比G N7原子慢，原子慢，故故3-甲基甲基A的配糖键比的配糖键比7-甲基甲基G脆弱。脆弱。所以前者的水解速率比后者快所以前者的水解速率比后者快46倍。倍。速率上的差别，是早期分析辨别速率上的差别，是早期分析辨别DNA中的中的G和和A的基本依据。最近采用六的基本依据

23、。最近采用六氢吡啶同氢吡啶同DNA甲基化反应，而这种反甲基化反应，而这种反应对甲基化的应对甲基化的G是特异的。因此，是特异的。因此，DNA链的断裂只在链的断裂只在G发生。发生。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.2.2 化学修饰法测序图解西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院C T+C G+A AAACAGTCCTACCGCTGAAGCA G+A T+C C试试看试试看你作对了吗？你作对了吗？西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.5.2.3 MaxamGilbert化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行返回目录返回目录西北师范大学西