预防血管成形术后再狭窄的C-sis反义寡脱氧核苷酸在血清中的

1、    预防血管成形术后再狭窄的C-sis反义寡脱氧核苷酸在血清中的稳定性        【摘要】目的探讨自行设计合成的C-sis癌基因反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis癌基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(PS-AODN)血清稳定性。方法用小牛血清模拟体内条件于不同时相点进行稳定性试验，用高效液相色谱法测定血清中AODN和PS-ODN。结果AODN在血清中1 h内降解43.3%，1天降解53.1%。PS-ODN 1 h降解23.7%，第6天降解59.6%。PS-AODN血清

2、中的稳定性明显高于AODN。结论PS-AODN在血清中有较好的稳定性，提示其具有潜在的临床应用价值。【关键词】反义寡脱氧核苷酸，硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸，稳定性，C-sis原癌基因 The Stabilization of C-sis Proto-oncogene Phosphorthioate Antisense Oligodeoxynucleotides Prevented Restenosis in SerumYang Min, Tang Qidong, Cai Lifeng, Lin Shuguang(Division of Clinical Pharmacology, Guangdo

3、ng Cardiovascular Institute, 510080)【Abstract】ObjectiveTo investigate the stabilization of the self-designed and synthesized C-sis phosphorthioate antisense oligodeoxynucleotides (PS-AODN) and C-sis proto-oncogene antisense oligodeoxynucleotides (AODN) in serum. MethodsThe stabilization of C-sis PS-

4、AODN and C-sis AODN in serum was tested in different time points with HPLC method.ResultsC-sis PS-AODN and C-sis AODN degradation rate were 23.7% and 59.6% in 1 hour and 6 day, 43.3% and 53.1% in 1 hour and 1 day, respectively.ConclusionsC-sis PS-AODN have good resistance to nuclease in serum.【Key w

5、ords】C-sis proto-oncogene; antisense oligodeoxynucleotides; antisense phosphorthuoate oligodeoxynucleotides; Stabilizition反义寡核苷酸作为治疗药物，在癌症和病毒感染方面的研究己取得了实质性的进展1。近年来，在心血管领域的研究也有了较大的进展。在动脉平滑肌细胞(ASMCs)增殖过程中，C-sis表达明显增高2。而C-sis癌基因的表达产物为血小板衍化生长因子B(PDGF-B)，是ASMCs迁移和增殖的重要促进因子3。在动脉粥样硬化(AS)及及冠脉成形术后在狭窄(RACA)中，

6、都有PDGF-B的过度表达。有报道表明，C-sis反义寡脱氧核苷酸(AODN)可显著抑制培养的SMCS增殖及C-sis表达4。为了进行更深入的研究和评价我们所合成的C-sis AODN和C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸(PS-AODN)在体外、体内的稳定性，我们建立了用高效液相色谱法测定血中C-sis PS-AODN和C-sis AODN的方法，模拟体内条件，进行了血清稳定性试验，比较两者对抗血清核酸酶降解的能力，为探讨所设计的C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸的临床应用提供实验依据。材料和方法1.1寡脱氧核苷酸合成用DNA合成仪，合成C-sis癌基因18 mer反义寡脱氧核苷酸(C-sis

7、antisense oligodeoxynucleotides, C-sis AODN)，合成过程中，以硫取代碘进行氧化，合成C-sis癌基因18 mer硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸(C-sis phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides, C-sis PS-AODN)碱基序列如下：3TACTTAGCGACGACCCGC51.2试剂盐酸甲氧乙心安(内标，广州何济公药厂提供，纯度99%)；乙腈(分析纯)；去离子水(广东省心血管研究所临床药理实验室Milli-QRG超纯水系统Ultra-pure Water Systen自制)；胎牛血清(天津中科院

8、产品)；灭菌注射用水(广州番禺市桥制药厂)。1.2仪器惠普1050高效液相色谱系列，DAD二级管阵列检测器，色谱工作站。1.3色谱条件色谱柱：YWG-CN 4.6 mm×150 mm，10 m柱，中国科学院物理化学研究所产品；0.1 M TEAA-乙腈-水(3：9：88，v/v)；流速：1.0 ml/min；检测波长、267 nm柱温：30。1.4稳定性试验分别取20 l C-sis反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸(PS-AODN)溶液，加入20 l胎年血清，充分混匀，于37温育，模拟体内进行6稳定性试验，分别于0、15、30、45、1 h、6 h、1

9、 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同时相点，取出样品，加入2 l内标液，加入80 l乙腈沉淀，3 000 rpm离心吸取上清液，真空干燥，残留物用40 l去离子水重溶，取10 l进样，进行色谱分析。用AODN或PS-AODN的峰高与内标的峰高比，计算两种反义寡脱氧寡核苷酸的体外降解率。结果2.1按色谱条件测定C-sis反义寡脱氧核苷酸、C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸和内标，血清中成分不干扰C-sis AODN、PS-AODN和内标峰的测定。40-320 g/ml血浓度范围内线性连良好。血清样品最低检出浓度为20 g/ml。日内、日间变异系数为1.55-11.5%。样品绝对回收率为96.

10、65±4.29%。样品血浓度测定方法适合作作内、外血浓度测定。2.2C-sis反义寡脱氧核苷酸和C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸在血清中，37温育，于0、15、30、45、1 h、6 h1 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同时相点的降解率分别为0-59.6%和0-89.6%，结果见表。表不同时间点的降解情况时间AODNPS-AODN峰高比降解率%峰高比降解率%03.6505.050152.3336.2303.3236.4452.2737.81 h2.0743.33.8523.76 h1.8948.23.7625.51 d1.7153.13.7425.92 d1.6255.63.

11、4032.73 d1.2466.02.9641.44 d0.8676.42.5250.16 d0.3889.62.0459.6(注：PS-AODN样品在15、30和45时间段内无数据) 讨论平滑肌细胞迁移和增生是内膜增生的主要特征，C-sis反义寡核苷酸可特异地阻断C-sis原癌基因的表达，从而抑制血管平滑肌细胞增殖。Pickering等发现，人增殖细胞核抗原mRNA的反义寡核苷酸可专一性地减少血管平滑肌细胞(VSMC)中DNA合成及增殖细胞核抗原蛋白含量。硫代修饰的核苷酸，可在36 h后在人VSMC中检测到，并能渗入人动脉硬化斑块中的细胞。因此，可望用反义寡核苷酸用于治疗血管增殖性疾病，尤其

12、是血管成形术后的病人血管的再狭窄。1，4 反义寡脱氧核苷酸用于治疗，在体内必须有一定的稳定性。稳定性好，则体内生物半衰期长，生物效应提高，用量减少，毒副作用减少，费用降低。提高稳定性，主要是增强抗核酸酶为43.3%，第6天降解率为89.6%。我们的研究分说明，硫代磷酸化修饰的C-sis PS-AODN具有较好的稳定性，提示其具有潜在的临床应用前景。研究中所用的C-sis硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸，在结构修饰上与其它反义寡脱氧核苷酸不同，我们是用硫取代碘氧化，对每个碱基进行硫代磷酸化修饰，使脱氧寡核苷酸中亚磷酸键氧化成稳定的硫代三磷酸酯健，从而明显提高抗血清核酸酶降解的能力，增强其血清中的稳定性。

13、我们的研究结果已表明，C-sis PS-AODN在体外血清半衰期为6天，具有良好的稳定性。但其体内是否具有同样的稳定性，有待进一步研究。作者单位:广东省心血管病研究所临床药理室，广州 510080)蔡立丰：中山大学生命科学院药学系实习生参考文献1吴耀生.反义寡核苷酸药用的基础研究.Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy, 1998; 25(8):1401442Dartsch PC, Bauriedel G, Schinko et al. Cell constitution and characteristics of human atherosclerotic p; aques selectively removed by percutaneous atherectory. Atherosclerosis. 1989, 80; 49533Linder V, Giiachelli CM, Schwartz SM et al. A subpopulation of xmooth muscle cells in injured rat arteries express platelet-derived growth factor-B chain mRNA. Circ Res, 1995, 76(6