银杏叶制剂对蛛网膜下腔出血早期大鼠脑缺血的影响

1、    银杏叶制剂对蛛网膜下腔出血早期大鼠脑缺血的影响        摘要目的：探讨银杏叶制剂（GBE）对蛛网膜下腔出血（SAH）早期缺血性脑损伤的防治作用。方法：对假手术组（SO组）、SAH组和SAH+GBE组大鼠检测24h内局部脑血流量（rCBF）、脑组织内皮素-1（ET-1）含量和Ca含量改变，并对海马CA1区组织作光镜检查。结果：SAH组于术后rCBF迅速而持续降低，脑组织ET-1含量和Ca含量在诱导SAH 1 h后均显著高于SO组，3 d后海马CA1区神经元明显受损

2、。 SAH+GBE组的上述改变均较轻。结论：GBE可减轻SAH后缺血性脑损伤。主题词蛛网膜下腔出血； 脑缺血； 内皮缩血管肽类； 大鼠中分类号 R 743.35文献标识码 A文章编号1000-4718(2000)03-0266-03 Effect of Ginkgo biloba extract on cerebral ischemia during early stage of subarachnoid hemorrhage in ratsSUN Bao-liang, XIA Zuo-li,YANG Ming-feng(Institute of Microcirculation, Affil

3、iated Hospital, Taishan Medical College, Taian 271000, China)GE Bao-lin(Department of Pathophysiology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021,China)AbstractAIM: To investigate the effect of Ginkgo biloba extrac (GBE) on cerebral ischemia during early stage of subarachnoid hemorrhage (

4、SAH). METHODS: Noncraniotomy models of SAH in Wistar rats were used and animals were divided into sham-operated group, SAH group and SAH+GBE group. Dynamic change of regional cerebral blood flow (rCBF) was detected. Brain endothelin-1(ET-1) and calcium contents were also determined at different time

5、 point during 24 hours after the operation. Pathological change of neurons of hippocampus CA1 region was observed. RESULTS: In SAH group, rCBF decreased immediately and persistently after induction of SAH. Values of brain ET-1 content and calcium content at 1 hour, 6 hours and 24 hours were signific

6、antly higher than those in sham-operated group. Neurons of hippocampus CA1 region were damaged severely 3 days after onset of SAH. Above abnormal changes in SAH+GBE group were much slighter than those in SAH group. CONCLUSION: GBE may relieve cerebral ischemic damage after SAH.MeSHSubarachnoid hemor

7、rhage; Cerebral ischemia; Endothelins; Rats蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后，可通过不同的机制造成脑缺血性损伤，由此使患者具有较高的病死率和神经功能伤残率1。银杏叶制剂（Ginkgo biloba extract,GBE）具有多种药理活性，并已在大脑功能不全、间歇性跛行及某些脑和血管性疾病中显示出突出疗效2。本研究用大鼠SAH模型，观察GBE对SAH后缺血性脑组织的保护作用。材料和方法一、动物与分组体重300350g的Wistar大鼠，雌雄兼用，随机分为假手术（sham-operated,SO）组8只、SAH组

8、和SAH+GBE组各32只。后组GBE(徐州邳州制药厂，质控指标为含银杏总黄酮甙27.5%,批号950322)于术前30 min按15 mg/kg腹腔注射给药,每隔6 h以同样的剂量追加1次。每组各用8只动态检测局部脑血流量（regional cerebral blood flow, rCBF），并对其中各5只于3 d后作海马CA1区组织光镜检查；每组各取部分动物（SO组8只，SAH组和SAH+GBE组各24只）检测不同时间脑组织内皮素-1（endothelin-1, ET-1)和Ca含量。二、动物模型复制参照Bederson等1的非开颅性方法，自大鼠右侧颈内动脉导入经10 mol/L硝酸处理

9、过的日本产碧水3号渔线（直径0.285 mm）至颈内动脉颅内段,刺破脑底动脉环的右前部造成SAH。三、rCBF检测在动物前囟后及中线左侧各3 mm处钻一直径23 mm小孔，在立体定向仪控制下，将激光多普勒血流计（LDF-pf2型，瑞典Perimed公司）探头垂直置于硬脑膜测量rCBF。四、脑海马区组织ET-1含量测定将大鼠分别在不同时间断头处死，迅速分离海马组织，加1 mol/L醋酸（w/v=10%），在水浴中煮沸10 min后匀浆。ET-1含量的测定采用放免法，试剂盒购于解放军总医院东亚免疫技术研究所。五、脑海马区组织Ca含量测定将分离的海马组织烘干称重后用混合酸（硝酸高氯酸=31）充分低温

10、湿法消化，用去离子水定容。利用火焰吸收法，在M3100型原子吸收分光光度计（美国PE公司）上测定Ca含量，波长为422.7 nm。六、脑海马组织形态学检查3 d后将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后开胸，自左心室穿刺入主动脉，用血管钳夹闭降主动脉，剪开右心耳。以120 cm H2O压力，先用生理盐水100 mL灌流，再用4%多聚甲醛溶液100 mL灌注固定脑组织。将大脑放入4%多聚甲醛溶液中继续固定24 h。在视交叉后1 mm处行冠状切开，常规切片，HE染色，对海马CA1区行光镜观察，计数其正常的神经元数量，并按下式计算神经元密度：神经元密度（神经元数/mm）=CA1区正常神经元数÷CA1区总长

11、度（mm）七、统计方法实验数据用±s表示，采用配对或组间t检验判断均数差异的显著性。结果一、SAH模型的验证SO组大鼠颅脑解剖无异常发现。在所有SAH模型动物的蛛网膜下腔，均发现有大量的血液或血凝块，呈弥漫性分布。均未发现脑实质的手术损伤。二、rCBF变化结果见表1。SO组动物在实验过程中rCBF保持相对恒定。SAH组在产生SAH后rCBF立即降低，1 h下降至最低值，在24 h内持续在低水平状态。SAH+GBE组在 SAH后rCBF下降的速度较慢，降低的程度明显小于SAH组。表1各组大鼠rCBF变化Tab 1Alteration of rCBF during the experim

12、ent in each group(±s,n=8,LDF unit)GroupPreoperationPostoperation00.51624(h)SO809.5±57.6775.1±69.1797.8±41.2839.3±78.2785.0±37.7807.2±54.3SAH821.4±87.3580.0±79.2*443.6±40.2*360.6±43.3*430.2±57.2*399.6±65.4*SAH+GBE818.1±62.6737.3

13、77;63.7*643.7±55.0*563.1±42.0*612.3±73.4*714.0±53.3*P0.01, vs preoperation or SO;P0.01,vs SAH 三、脑海马区组织 ET-1含量和Ca含量改变结果见表2。在术后124 h，SAH组脑海马区组织ET-1含量明显高于SO组。SAH+GBE组在SAH后6 h、24 h脑海马区组织ET-1含量均较 SAH组明显为低。SAH组在诱导SAH后1 h、6 h、24 h脑海马区组织Ca含量较SO组为高，以24 h最为明显。SAH+GBE组上述各时间的脑海马区组织Ca含量均显著低于S

14、AH组。表2各组大鼠脑海马区组织ET-1含量和Ca含量变化Tab 2Alteration of hippocampus ET-1 content andCa content in each group(±s,n=8)GroupET-1(pg/mg)Ca(mol/g dry brain)SO7.12±3.02 11.38±1.79SAH1 h postoperation10.93±3.91*14.95±2.32*6 h postoperation17.61±5.19*19.99±2.69*24 h postoperation1

15、8.37±5.00*24.54±2.13*SAH+GBE1 h postoperation9.32±3.4813.03±1.736 h postoperation11.63±3.05*16.57±1.84*24 h postoperation12.12±4.17*18.41±1.43*P0.05,*P0.01, vs SO;P0.05,P0.01,vs SAH 四、海马CA1区组织形态学变化在手术后3 d，SO组海马皮质CA1区形态正常，锥体细胞着色均匀，核略呈椭圆形，辐射层纤维较长而呈垂直排列。SAH组海马 CA

16、1区锥体细胞数目明显减少，且多深染变暗或固缩。而SAH+GBE组海马CA1区锥体细胞则得以较好保存。SO组、SAH组、SAH+GBE组海马CA1区神经元密度分别为(213.74±26.32)个/mm,(96.30±35.78)个/mm和(178.83±41.60)个/mm;SAH组明显低于SO组(P0.01)，而SAH+GBE组又显著高于SAH组（P0.01）。讨论本实验观察到，大鼠SAH后rCBF迅速而持续降低，在所观察的24 h内无明显恢复，提示有脑缺血发生。SAH后rCBF减低的原因可能包括脑部主要血管的痉挛、脑灌注压降低以及脑微循环功能状态异常1,3。实验

17、还表明，SAH后脑组织ET-1含量和Ca含量明显增多，海马CA1区锥体细胞明显受损。SAH时对脑血管的牵张与刺激、脑灌注压下降、红细胞释放的氧合血红蛋白等物质，以及继发性缺血缺氧刺激，可使血管内皮细胞、某些神经元或胶质细胞ET-1 mRNA表达而产生过多的ET-1。ET-1的增加可造成脑部大血管和微血管痉挛而导致脑缺血；同时还可能通过促进谷氨酸等兴奋性氨基酸释放，以及激活磷脂酶C和间接开放电压依赖性Ca2+通道，使神经细胞内Ca2+超载，而加重脑组织缺血性损伤4。GBE主要含有黄酮类和萜内酯类等化学成分。前者包括30多种化合物，后者主要由银杏内酯A、B、C、M、J和白果内酯组成。本实验表明，G

18、BE可阻止SAH后rCBF下降、脑组织ET-1和Ca含量的增加，并能显著减轻海马CA1区锥体细胞损伤。既往的研究证实2,GBE可扩张外周血管、冠状血管和脑血管。GBE中的黄酮类化合物具有抗炎及抗自由基作用5，因此可以减轻SAH时上述因素对血管内皮细胞的损伤，减少ET-1的病理性释放。而银杏内酯（尤其是银杏内酯B）是特异的血小板激活因子（platelet activating factor, PAF）拮抗剂2，因此可防止SAH时PAF诱导的血小板、白细胞聚集粘附对血管内皮细胞的损伤6，从而改善血管内皮细胞功能，减少内皮源性ET-1的过度释放。银杏内酯亦可能阻断PAF诱导血小板释放的5-羟色胺、三

19、磷酸尿苷等的血管收缩作用6。GBE中的黄酮类和萜内酯类物质均可清除超氧阴离子等自由基5，从而使一氧化氮半衰期延长，进一步抑制ET-1的合成和释放。随着脑缺血刺激的缓解，神经元和胶质细胞等生成的ET-1亦逐渐回降。ET-1水平的回降可使脑部血管的痉挛得以缓解，改善脑血供；同时减轻了ET-1的神经毒作用。已知自由基和PAF均参与了脑缺血损害过程。因此，具有抗自由基效应和PAF拮抗剂特性的GBE亦可能提高脑部神经元对缺血缺氧的耐受性68。但其具体机制尚待进一步探讨。孙保亮（泰山医学院附属医院微循环研究所，山东 泰安 271000）夏作理（泰山医学院附属医院微循环研究所，山东 泰安 271000）杨明

20、峰（泰山医学院附属医院微循环研究所，山东 泰安 271000）葛宝林（青岛大学医学院病理生理教研室，山东 青岛 266021）参考文献1Bederson JB, Germano M,Guarino L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in rats J. Stroke, 1995,26:10861091.2Kleijinen J,Kinpchild P. Ginkgo biloba J. Lancet, 199

21、2,340:11361139.3Todo H,Ohta S,Wang JZ,et al. Impairment in biochemical level of arterial dilative capability of a cyclic neucleotides-dependent pathway by induced vasospasm in the canine basilar arteryJ. J Cereb Blood Flow Metab，1998,18:808817.4Zuccaerllo M, Romano A, Passalacqua M, et al. Decreased endothelium-dependent relaxation in subarachnoid hemorrhage-induced vasospasm: Role of ET-1 J. Am J Physiol， 1995,269: H1009H1015.5Shen JG, Zhou DY. Efficiency of ginkgo biloba extract (Egb761) in anti