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文档简介
1、Lenti-X HTX 高效慢病毒包装系统操作一览 PT5135-2目录重要 . 1存储 &处理 . 1转染操作 . 2重要:以下操作是针对 Lenti-X 载体, Lenti-X HTX 高效包装系统和 Lenti-X 293T 细胞系 (Cat.No. 632180的优化操作。转染操作需在 100 mm 培养板 中进行, 转染培养基和收集病毒的培养基中需使用 TetSystem Approved FBS (无四环素污染 。以下所有操作需在无菌环境下进行, 需要使用生物安全等级为 2的仪器设备进行病毒操作并做好自身的防护措施。存储 &处理: 使用前, 室温解冻 Xfect P
2、olymer (100 g/l 。 解冻后, 将 Xfect Polymer 置于 4°C 保存,最多 12 months。 使用前,室温解冻 Xfect Reaction Buffe。解冻后摇匀,将 Xfect Polymer置于 4°C 保存, 最多 12 months。 使用完 Xfect Polymer后,盖紧管盖,放回带有干燥剂的锡箔袋。 Figure 1. Lenti-X 293T细胞最优转染密度 (左图 和转染后细胞检测时间 (右图 , 转染筛选标记是 ZsGreen绿色荧光蛋白。转染操作(100 mm板:1. 转染前约 24 hr, 以 4 5 x 10e6
3、Lenti-X 293T细胞 /100 mm板 的密度接种 10 ml细胞, 37°C 、 5% CO2 培养过夜。转染时的细胞融合度应该为 80 90%。2. 漩涡混匀 fect Polymer。3. 对于每个转染样本,准备 2个离心管,按照以下顺序混匀试剂:注意 Xfect Polymer预混液室温放置不要超过 30min 。4. 漩涡混匀各管混合物。5. 将 Xfect Polymer预混液和 DNA 预混液以适中的速度漩涡 10sec 。6. 室温孵育 10 min,以形成便 Xfect/DNA复合物。7. 将 1200ul 纳米复合物逐滴加入细胞培养基中,然后前后摇晃混匀。
4、注意 : 无需去除培养基中的血清,当纳米复合物加入培养基后,培养基的颜色会有些改变,这是 正常的。8. 37孵育培养板。9. 4 hr 后,吸走培养基,然后加入 10ml 新鲜培养基 (含 Tet System Approved FBS ,将培 养板放回 37培养箱继续培养 24-48 hr。一般来说,在转染后 48hr 时病毒滴度最高。 警示 :含有病毒的培养基需经过处理。10. 收获病毒上清。 警示 :上清中包含传染性的病毒。 短暂瞬时离心 (500 x g, 10 min或 使用 0.45 m过滤器过滤来去除细胞碎片。注意 : 过滤器使用醋酸纤维素膜或多聚磺酸纤维素膜 (蛋白结合能力低 ,切勿使用硝酸纤维素 膜,以防硝酸纤维素膜结合的蛋白破坏病毒。11. 使用 Lenti-X GoStix 检测病毒产量, 鉴定病
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