虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用

1、    虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用        摘要目的和方法：观察虎杖甙(PD)对人脐带动脉平滑肌细胞(VSMC)内游离钙、细胞膜电位的变化，以探讨PD对血管平滑肌的调节机制。用Fluo-3-AM、DiBAC4(3)标记培养的VSMC，在激光共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙和膜电位变化。结果：给PD(0.5 mmol/L)10 min后，VSMC内游离钙浓度升高56%±5.6%。当PD加入前用维拉帕米和EGTA预处理后，则游离钙不再升高；E

2、GTA和肝素预处理也抑制PD的升钙作用，而EGTA和普鲁卡因预处理则使细胞内钙显著升高。PD还可使VSMC膜电位去极化，加入钠通道阻断剂河豚毒素(2.5 molL)可完全阻断PD的去极化作用：加甲氰咪胍、维拉帕米、优降糖和利及丁预处理不能阻断PD去极化作用。结论：PD可通过细胞外钙内流来增加细胞内游离钙浓度，并促进细胞外钠离子内流而导致细胞去极化。主题词肌，平滑，血管；钙；膜电位 The regulation of Polydatin on intracellular free calcium and membrane potential of human vascular smooth mu

3、scle cellsJIN Chun-Hua,ZHAO Ke-SenDepartment of Pathophysiology， First Military Medical University,Guangzhou(510515)AbstractAIM：The present study was to investigate the regulation mechanism of Polydatin on human blood vessels.METHOD：The changes of the cytosolic free calcium concentration and cell me

4、mbrane potential of cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) were determined kinetically between passages 3 and 8 isolated from human umbilicus artery.RESULTS：Polydatin (0.5 mmol/L) caused a persistent increase of intracellular calcium concentration Ca2i,which was inhibited completely by pretrea

5、tment with EGTA(2 mmol/L) and verapamil(50 mol/L)10 min prior to Polydatin givening,and was also blocked completely by pretreatment with EGTA and heparin(765×103 U/L).But the effect of polydatin onCa2i was enhanced by pretreatment with EGTA and procaine(10 mmolL).Polydatin can also make the cel

6、l membrane potential less negative or depolarized 10 min after polydatin adding.The effects of Polydatin were enhanced significantly by pretreatment with cimetidine,but it was inhibited completely by pretreatment with tetrodotoxin(2.5mol/L),a kind of sodium channel blockerCONCLUSIONS：Polydatin-induc

7、ed alternation inCa2i might be mainly due to the entry of extracellular Ca2+ into cells and release from IP3 sensitive intracellular calcium store,and ryanodine receptor system might regulate negatively IP3 receptor system. And polydatin might induce the entry of sodium ion into cells and cause the

8、depolarization of VSMC.MeSHMuscle,smooth,vessels;Calcium;Membrane potentials以往动物实验13发现虎杖甙(polydatin,PD)具有调节血管口径、改善微循环灌流等功效，对休克病人治疗也有显著疗效。但对正常人血管的作用及其机制不完全清楚。本研究用激光共聚焦显微镜观察PD对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)内钙离子浓度(Ca2i)和膜电位的影响以探讨其对人血管的调节机制。材料与方法(一)材料：人脐带取自南方医院妇产科，虎杖甙由本校化学教研室提纯制备，用D-Hanks液配，

9、终浓度为0.5 mmolL)。荧光探针Fluo-3-AM(测钙)、DiBAC4(3)(测膜电位)(美国Molecular Probe公司)，激光共聚焦显微镜570型(ALAS570，美国Meridian公司)，河豚毒素(TTX,Sigma),其它为国产试剂。EGTA、维拉帕米、TTX、优降糖、利及丁、甲氰咪胍、肝素和普鲁卡因均用D-Hanks液分别配制成2 mmolL、50 molL、2.5 molL、2.5molL、250 mgL、2.5 gL、765×103UL、10 mmolL。(二)方法：1.人脐带VSMC分离：无菌剥离一段脐带动脉，去除内、外膜，将血管切成约1 mm2大小贴

10、入培养瓶，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置35 h翻转，于37、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中静置3 d,然后每2 d换液。取38代细胞做实验。2.荧光染料配制：Fluo-3-AM和DiBAC4(3)用含20 mmolL HEPES的无血清DMEM缓冲液分别配成10mol/L和5mol/L，-20避光保存。3.VSMC的荧光染色测定：实验前2 d将VSMC传代至测定小皿上，测定前用无血清DMEM缓冲液洗涤小皿23遍，加入荧光染料2滴，37避光温育3060 min，再用缓冲液洗3遍(测膜电位不用洗，保留染料)，即可上机测定。4.VSMC内游离钙、膜电位的测定4，5：利用特异荧光染料

11、，ACAS 570可敏感检测可贴壁粘附活细胞的Ca2i和膜电位的动态变化。在488 nm波长蓝色激光激发下Fluo-3产生的荧光强度与细胞Ca2i浓度成正比；而根据DiBAC4(3)在细胞内外的重新分布可以判断出细胞膜电位的变化，当DiBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强时，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化。5.实验分组：实验设对照组、PD组、阻断剂处理组(加EGTA、维拉帕米、TTX等阻断剂预先孵育10 min再加PD处理)，分别测定加入PD后10 min内VSMC内钙离子浓度和膜电位的动态变化。(三)数据处理：数据经ACAS-570微机系统对形及时间进行实时测量而获得，以未加PD处理前

12、的荧光值为100(%)，以均数±标准差表示，数据以student's t检验进行显著性分析。结果一、PD对细胞Ca2i及膜电位的影响：单纯加PD后，平滑肌细胞Ca2i立即升高，1 min细胞Ca2i即增加(29±2.8)%，10 min后细胞Ca2i增至(56±5.6)%(与初始值相比，P0.01，n=3)(1)。而正常细胞膜电位在加入PD后出现负值减小细胞内荧光强度10 min后增加(13.2±1.9)%(与初始值相比，P0.05，n=5),见(3)。Fig 1The effects of polydatin on intracellular

13、free calcium of vascular smooth muscle cells (±s，n=3)*P0.01,vs control group 1虎杖甙对VSMC内Ca2i的影响Fig 2The influence of blockers on the effects of polydatin on cytosolic free calcium(±s，n=3)*P0.05，*P0.01，vs baseline P0.05，P0.01，vs PD group 2阻断剂对虎杖甙升钙作用的影响Fig 3The effects of polydatin on cell m

14、embrane potential of vascular smooth muscle cells(±s，n=5)*P0.05，vs control group3虎杖甙对VSMC膜电位的影响二、阻断剂对PD升钙作用的影响：EGTA+维拉帕米预先温育10 min，再加PD，发现细胞Ca2i不再升高而呈下降趋势，10 min后只有起始钙浓度的(77±8.9)%(n=4)；EGTA+肝素预处理的结果与EGTA+维拉帕米作用相似，也是使细胞内钙下降，10 min时细胞Ca2i只有最初的(85.5±2.1)%(n=3)，与PD组相比差别显著(P0.01)；而EGTA+普鲁卡

15、因预处理后，细胞Ca2i在加入PD后出现急剧增加，1 min后增至最初的(174.3±13.8)%10 min时仍达(135.7±6.7)%(与PD组相比，P0.05)，见(2)。三、阻断剂预处理对膜电位的影响：当用维拉帕米、优降糖和利及丁分别温育10 min，PD仍使细胞膜电位负值减小，荧光强度10 min后仍分别增加(26.5±2.1)%、(19.5±3.5)%、(24.5±4.9)%。与PD组相比，膜电位下降更明显(P值分别为P0.01，P0.05，P0.01，n=3)；但用钠通道阻断剂河豚毒素预处理时，细胞膜电位不再去极化，而是几乎保持

16、在基线水平荧光强度减少(2±1.4)%，n=3,与PD组相比，差别非常显著(P0.01)，但用甲氰咪胍预处理后，PD却使细胞膜电位负值明显减少，10 min后荧光强度比最初高(110±14.1)%，差别非常显著(P0.01)，见(4)。Fig 4The influence of blockers pretreatment on cell membane potential(±s，n=3)*P0.05，*P0.01，vs baselineP0.05，P0.01，vs PD group 4阻断剂预处理对VSMC膜电位的影响讨论血管平滑肌是调节血压和微循环灌流量的重要因

17、素。VSMC内游离钙浓度及细胞膜电位变化则对VSMC的收缩有直接的调节作用。研究表明6，7，当VSMC膜上电压敏感钙通道开放，外钙内流使胞浆游离钙浓度升高后可引起VSMC收缩。细胞膜电位变化可调节血管张力，主要是通过电压依赖性钙通道来实现。钙通道处于开放或关闭状态的时间比例是由膜电位调节。许多受体介导的激动剂引起血管收缩，其中部分原因就是直接或通过膜去极化来增加钙通道的开放概率；而很多血管扩张剂的作用是通过直接抑制钙通道或间接通过激活ATP敏感钾通道引起的超极化所致8。在本实验中发现PD可使人脐动脉VSMC内游离钙升高，以及使细胞膜电位负值变小出现去极化反应。表明PD可能会使人正常状态的平滑肌

18、张力增加，收缩程度加强。当用EGTA和维拉帕米预处理后，PD不再使细胞Ca2i升高，表明PD作用主要是促使细胞外钙离子内流。EGTA与IP3受体拮抗剂肝素合用也抑制了PD的升钙作用，而EGTA与ryanodine受体拮抗剂普鲁卡因预处理后再加PD却使细胞Ca2i显著升高。提示PD能使细胞内IP3敏感钙池释放钙离子增加，特别是当ryanodine敏感钙池被抑制后，可能因反馈作用使IP3敏感钙池释放钙增多。另外用维拉帕米预处理再加PD时，细胞膜电位负值明显减小，1 min就出现了明显的去极化，其原因可能是在细胞外钙阻断情况下，PD使细胞内游离钙释放增加所致。而给予钾通道阻断剂优降糖预处理后产生的协

19、同作用可能是由于VSMC本身出现的自发性外向钾电流被阻断的结果。研究证明9，10，当胞浆中钙浓度升高时可触发一些钾通道开放，引起外向钾电流而使细胞超极化。而利及丁预处理产生的协同作用机理尚不清楚。当给予河豚毒素后PD不再使细胞膜电位改变，提示PD可能是通过钠离子内流而使VSMC发生去极化的。根据以上结果推论，PD可能是一种钠通道激动剂，它首先使细胞膜上钠通道开放，使细胞外钠离子内流引起细胞去极化。当细胞膜电位负值减小时触发细胞膜上电压依赖性钙通道开放，使细胞外钙离子内流，引起细胞浆游离钙浓度增加，通过Ca2-Calmodulin-肌球蛋白轻链激酶通路引起细胞张力增加。作者单位：第一军医大学病理

20、生理教研室(广州510515)参考文献1赵克森，朱佐江，吴坤莹，等.虎杖甙对重症休克的治疗作用.见：李超林，主编.军事医学荟萃.第1版.北京：军事医学出版社，1996.138142.2吴坤莹，赵克森，朱佐江.虎杖4号对烧伤性休克大鼠微循环紊乱的防治作用.中华整形烧伤外科杂志，1992，(2)：133.3朱佐江，赵克森，吴坤莹，等.虎杖4号对休克大鼠脉压差和微循环灌流量的影响.中华医学杂志，1989，69：279.4张薇，朴英杰，鲍永耀，等.粘附式细胞仪测定巨噬细胞内游离钙的方法.第一军医大学学报，1994，14(1)：43.5张薇，鲍永耀，李奈林，等.粘附式细胞仪测定主动脉平滑肌细胞膜电位的方法