肺泡灌洗液中淋巴细胞表型的测定及临床意义

1、肺泡灌洗液中淋巴细胞表型的测定及临床意义     崔巍马文新张峰    摘要目的：建立以流式细胞仪（FCM）检测肺泡灌洗液（BALF）中淋巴细胞表型的方法并对其临床意义进行研究。方法：采用FITC-CD45/PE-CD14设门并结合PI染色排除非淋巴细胞、细胞碎片等对检测的干扰，以FCM分析43例肺部疾病患者BALF和对照组外周血中淋巴细胞上各抗原的表达，并与免疫组化检测方法进行方法学比较。结果：FCM法与免疫组化法相关良好（r0.806），其精密度（CV1.0%）远优于免疫组化法（CV9.8%）。43例BALF中

2、T细胞亚群较外周血有明显变化（P0.01），并且在某些肺部疾病中有独特的改变。结节病：细胞表面分化抗原(CD3)和CD4细胞明显增多，CD8细胞数目明显下降，CD4/CD8比值升高；特发性肺间质纤维化(IPF)：CD8细胞显著增多，CD4细胞显著降低，CD4/CD8比值明显降低；肺部肿瘤：CD3细胞数目无明显增多，但CD4/CD8比值下降；肺结核患者T细胞亚群在正常值范围之内，BALF和外周血之间差异无显著意义（P0.05）。结论：FCM法准确快速、并可进行多参数分析，适合成分复杂、常混有痰液和杂质的BALF标本的检测；BALF中T细胞亚群的改变对肺部疾病的鉴别诊断有重要意义。 &#

3、160;  关键词:肺泡灌洗液；流式细胞术；淋巴细胞表型；T细胞亚群    支气管肺泡灌洗检查，可以直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液，对其所含的炎症细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群测定，可为结节病、过敏性肺泡炎、特发性肺间质纤维化（IPF）、肺部恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和疗效观察提供帮助1。但是，由于检测方法的局限性，支气管肺泡灌洗液（BALF）淋巴细胞亚群的检测在国内尚未能普遍开展，只有少数实验室采用免疫组化法（PAP法）进行测定1。此法结果的可靠性受人为因素干扰大。随着流式细胞术（FCM）应用的发展，以免疫荧光标记的单克

4、隆抗体（McAB）能够快速准确地测定细胞表面抗原的表达，克服了免疫组化法的缺陷2。    本实验室采用免疫荧光三色分析，建立了以流式细胞仪检测BALF中淋巴细胞表型的方法，并以T细胞亚群为例，对其在肺部疾病中的不同表达进行了研究。    图1肺泡灌洗液中的白细胞在CD45/CD14荧光散点图中的分布，L：淋巴细胞，M：单核细胞/巨噬细胞，N：中性粒细胞    图2图1中的淋巴细胞群在FSC/SSC散点图中的位置，即B门内细胞    图3

5、B门内淋巴细胞在PI/FSC散点图中的分布，C门内为碘化丙啶阴性的活细胞，D门内为碘化丙啶阳性的死细胞    材料和方法    一、材料    1.试剂：双标抗体FITC-CD3/PE-CD4、FITC-CD3/PE-CD8、FITC-CD45/PE-CD14和同型匹配的无关鼠IgG、溶血素购于美国Becton-Dickinson(BD)公司；荧光校准微球Flow Check购于美国Beckman Coulter Immunotech公司；碘化丙啶（PI）购于Sigma公司；

6、免疫组化法检测T细胞亚群试剂盒购于元康生物技术公司。    2.仪器：Coulter EPICS ELITE ESP型流式细胞仪。    二、方法    1.实验对象：43例BALF标本均取自北京协和医院门诊或住院患者。男19例，女24例，其中结节病14例、IPF16例、肺部肿瘤7例、肺结核6例。并取同一患者的外周血作为对照组。    2.BALF样品的制备：取新鲜BALF 10 ml，过滤去杂质和痰液，离心后去上清（300 g，5 m

7、in），再用含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，计细胞数，调整浓度为106个细胞/ml/管，加入20l荧光抗体，室温避光孵育20 min，加入PI染液（10 g/ml），室温避光孵育20 min，另取一管不加PI作为阴性对照。    3.外周血样品的制备：取新鲜抗凝外周血100 l，加入20 l荧光抗体，孵育20 min，加入溶血素2 ml，孵育10 min，洗2次，加入500 l PBS待测。    4.流式细胞仪测定：以Flow Check校准仪器光路，使Half CV小于2%。调

8、整荧光补偿，建立细胞表面分化抗原(CD)45/CD14的荧光散点图，根据不同细胞CD45和CD14表达的荧光强度不同，可将淋巴细胞（L）、单核/巨噬细胞（M）、中性粒细胞（N）清楚地区分开（图1）。圈定淋巴细胞群，以此确定淋巴细胞群在前向（FSC）/侧向（SSC）散点图中的位置，见图2中“B”门内细胞。建立FSC/PI对数散点图，区分活的淋巴细胞（细胞膜完整，PI染色阴性）和死的淋巴细胞（细胞膜受损，PI染色阳性），见图3。建立FITC/PE荧光散点图，分析排除干扰后淋巴细胞表面CD3、CD3CD4和CD3CD8抗原的表达情况。    5.PAP法测定：

9、将BALF中经过滤、离心后获得的细胞固定于载玻片上，按试剂盒说明进行染色，在显微镜下计数阳性细胞。    结果    1.FCM法和PAP法测定结果的比较：两种方法测得的43例BALF标本中CD3、CD4、CD8和CD4/CD8均有很好的相关性（r0.806），但t检验结果差异有显著意义（P0.05），说明两种方法间有系统误差（表1）。    2.FCM法和PAP法精密度比较：选取10例T细胞百分数高、中、低不同的BALF标本，用两种方法分别重复测定10次，FCM法的精密度明

10、显优于免疫组化法（表2）。    3.FCM法测定不同疾病BALF和外周血T细胞亚群结果：如表3所示，除肺结核外，其他3种肺部疾病患者BALF中 t细胞亚群的分布较之外周血的差异都有显著意义（P0.01）。    表1两种方法测定的淋巴细胞亚群结果比较*(x±s，%)          项目    CD3    CD4 

11、0;  CD8    CD4/CD8     FCM法    84.9(7.6)    37.6(20.5)    46.1(25.3)    2.3(2.8)     PAP法    78.2(7.1)    35.1

12、(25.7)    41.8(27.4)    2.1(3.5)     r         0.806          0.923          0.942    

13、;      0.899     P    0.01    0.05    0.01    0.01    *n=43；括号内为±2s数据    表2FCM法和免疫组化法精密度比较（CV，%）     

14、0;    方法    CD3    CD4    CD8     FCM法         0.6          1.0         

15、60;0.3     PAP法    13.7    15.6    9.8    表3BALF和外周血中T细胞亚群的比较(x±2s)          疾病类型    例数    BALF淋巴细胞亚群（） &

16、#160;  外周血淋巴细胞亚群（)     CD3+    CD4+    CD8+    CD4/CD8    CD3+    CD4+    CD8+    CD4/CD8     结节病  &

17、#160;      14          91.8±5.62          70.6±11.2          14.5±8.40         &

18、#160;6.9±3.12          72.3±3.98          45.6±8.93          25.1±6.21          1.4±0.65 &

19、#160;   IPF    16    94.5±3.91    14.7±3.12    78.4±7.92    0.2±0.04    71.8±2.55    31.4±3.18    48

20、.7±5.24    0.6±0.21     肺结核    6    74.3±5.61    42.3±1.92    32.1±1.21    1.3±0.05    67.5±4.32 

21、60;  41.2±2.41    29.5±1.30    1.3±0.05     肺部肿瘤    7    67.5±10.4.    24.3±5.24    35.1±9.62    0.7

22、±0.13    61.4±7.58    34.9±4.12    31.5±9.38    1.2±0.17         讨论    1.流式细胞术较免疫组化法测定结果更为准确：首先，人工镜检时通常只计数200个细胞，而FCM可在短时间内检测1万个以上

23、细胞，大大降低了随机因素对结果的干扰；其次，FCM对荧光信号的分辨率是肉眼难于比拟的，当样品中淋巴细胞数目较少时（5%），荧光镜检无法准确分辨出微弱的阳性细胞，而FCM则可对仅有1的淋巴细胞进行准确的表型分析3。最为重要的是，免疫镜检法只能对单一抗原进行分析，而FCM可同时对不同波长的多标抗体进行分析，大大提高了检测的准确性。例如，荧光镜下所见的CD8+细胞，既包括了CD3+CD8+细胞（T抑制/杀伤细胞），又包括了CD3-CD8+细胞（非T抑制/杀伤细胞）。而FCM因其可同时分析不同荧光标记的CD3、CD8细胞，所以可准确测定出CD3+ cD8+细胞的百分数。  

24、0; 2.流式细胞术检测BALF淋巴细胞表型时方法学的改进：以CD45/CD14设门并结合PI染色，可准确分析淋巴细胞抗原表型，尤其适用于成分混杂、经常混有痰液和杂质的BALF标本。CD45是白细胞特异性抗体，但在不同白细胞上其表达的荧光强度不同。淋巴细胞表达最高，单核细胞次之，中性粒细胞最弱。CD14则在单核细胞、巨噬细胞表达强烈，在粒细胞表达微弱，T细胞、红细胞和血小板上无表达。因此采用CD45/CD14设门，可准确找到淋巴细胞群，排除其他成分的干扰（图1）。而采用DNA染料PI，可以鉴别细胞膜的完整性。在未固定的标本中，PI可穿透破损的细胞膜对DNA染色，而无法穿透完整细胞膜。

25、因此，加入PI与单抗同时染色，可排除破损细胞（PI染色阳性）对淋巴细胞的干扰。    3.BALF中淋巴细胞亚群检测的临床意义：表3结果表明，多种肺部疾病表现出肺局部免疫功能的变化，如结节病是以CD4细胞占优势的淋巴细胞性肺泡炎；尽管Crystal提出IPF是中性粒细胞性肺泡炎的观点，但目前研究表明，中性粒细胞虽然重要，有可能不是唯一的致损伤细胞，淋巴细胞介导的细胞毒作用也确有可能起损伤细胞的作用4。本实验与许多学者的结果都表明，IPF患者BALF中的细胞毒性T细胞（CD3+CD8+细胞）明显增多，其变化与结节病表现绝然不同1。这不但反映了二者发病机制有所区别，更能以此作为二者的鉴别诊断指标；肺部肿瘤患者BALF中CD4/CD8比值下降较之外周血明显说明局部肺组织自身免疫功能下降，致使肿瘤细胞得以快速生长；尽管肺结核病是以局部细胞免疫功能改变为主，但这种改变