植物组织渗透势的测定(质壁分离法)

1、实验1 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）原 理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的深液浓度。代入公式即可计算出春渗透势。仪器药品显微镜 载玻片及盖玻片镊子 刀片配成0.50.1mol/L梯度浓度的蔗糖溶液各50ml。称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1m0le/L（母液）。再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.

2、45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml操作步骤将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。撕取下表皮，迅速分

3、别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，510分钟后，从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。将结果记录下表中。测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式

4、计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。为细胞渗透势。R为气体常数=0.083×105/L·P/mol·K。T为绝对温度，单位K，即273+t，t为实验湿度。I为解离系数，蔗糖为1。C为等渗溶液的浓度，单位为mol/L。则：=0.083×105×(273+t)×1×C实验人 时期 材料名称 实验时室温 蔗糖摩尔浓度（mol/L）渗透势（P）质壁分离的相对程度（作图表示）0.500.450.400.350.300.250.200.150.10实验2 植物组织水势的测定（小液流法）原理水势表示水分的化学势，象电流之由高电位处流向低电

5、位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。仪器药品试管 毛细滴管移液管 剪刀镊子 甲烯蓝操作步骤首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6

6、、0.7、0.8 mol/L）各10 ml注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。用剪刀将菠菜叶剪成约0.5cm2大小相等的小块6080片。向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片）的叶片小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，向每一试管中各加甲烯蓝粉末少许，并振荡，此时溶液变成蓝色。用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢从毛细滴

7、管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比重比原来小了；如果有色液向下移动，则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度。重复测定一次。按计算水势。式中为细胞水势，其余符号同实验4。注意：毛细滴管要各个浓度专用。实验3 蒸腾强度的测定（钴纸法）原理本实验方法系根据氯化钴纸在干燥时为蓝色，当吸收水分后，变为粉红色，根据变色所需时间的长短，然后按钴纸标准吸水量计算出作物蒸腾强度。仪器药品扭力天平 烘箱干燥器

8、瓷盘镊子 剪刀玻璃板 载玻片薄橡皮 有塞指管滤纸 弹簧纸夹5%氯化钴溶液（9.2g CoCl1·6H2O用蒸馏水配成100ml）滴几滴盐酸调成弱酸性。操作步骤1氯化钻纸的制备选取优质滤纸，剪成0.8cm宽，20cm长的滤纸条，浸入5%氯化钴溶液中，待浸透后取出，用吸水纸吸去多余的溶液，将其平铺在干洁的玻璃板上，然后置于6080烘箱中烘干，选取颜色均一的钴纸条，小心而精确地切成0.8cm的小方块，再行烘干，取出贮于有塞指管中，再放入氯化钙干燥器中备用。2钴纸标准化使用前，先将钻纸标准化。测出每一钴纸小方块由蓝色转变成粉红色需吸收多少水量。取12钴纸小方块，置于扭力天平上称重，并记下开始

9、称重的时间，及每隔一分钟记一次重量，当钻纸蓝色全部变为粉红色时，要立即准确地记下重量和时间，如此重复数次，计算出钻纸小方块由蓝色变为粉红色时平均吸收多少水分，以mg表示，作为钴纸吸水量。3测定取二片玻片，薄橡皮一小块，在其中央开1cm2的小孔，用胶水将它固定在玻片当中，另准备一只弹簧夹。用镊子从干燥器（管）中取出钻纸小块，放在玻片上的橡皮小孔中，立即置于待测作物叶子的背面（或正面），将另一玻片在叶子的正面（或背面）的相应位置上，用夹子夹紧，同时记下时间，注意观察钻纸的颜色变化，待钻纸全部变为粉红色时，记下时间。以时间的长短作相对比较，可用钻纸小方块的标准吸水量成小纸块由蓝色变为粉红色所需的时间

10、来计算术为该叶片表面蒸腾的强度，用mg/cm2·min表示之。本实验可选择不同作物的功能叶片，或同一作物的不同部位的叶片测其蒸腾强度，或者可测定作物在不同环境条件下的蒸腾强度。例如光和暗对植物蒸腾作用的影响，事先把一组盆栽的蚕豆、小麦或其他植物放在黑暗中过夜或几个小时，另一组放在光下，二者都要适当灌水，分别测其蒸腾强度（注：黑暗中的植物在测定时可移到实验室柔和的光线下进行）。 每一处理最少要测10次左右，然后求其平均值。实验4 小孔的扩散（示范）原 理气孔蒸腾是植物散失水分的主要途径，气孔口很小，其总面积一般不超过叶面积的1%，可是叶子通过气孔蒸腾所损失的水分却达到与叶面积相等的自由

11、表面的5080%，如此惊人的蒸腾量，可以用小孔扩散原理加以说明。水分通过小孔扩散的量和小孔的周缘长度成正比，而和小孔面积不成比例。通过此试验所产生的现象，可以证明小孔边缘效应的存在。仪器获品小烧杯 台天平 培养皿 刀片 尺及解剖针 卡片纸 1%琼脂 石蜡 红墨水或蓝墨水 酒糟或丙酮操作步骤1物质通过小孔扩散的途径预备聚乙烯塑料薄膜（可用食品袋）一张，大小约5×5cm，取解剖针于煤气灯上加热，在薄膜中央穿刺一小孔。配制1%琼脂，倒在一小烧坏中，如用10ml小烧杯，则更易于观察。待琼脂还未完全凝固时，将薄膜小心地贴在琼脂的表面，使小孔位于烧杯的中央。等琼脂凝固后，在薄膜上面倒上有色溶液少

12、许。45小时后，即可看到有色溶液通过小孔向琼脂凝胶中扩散，形成一个有色的半球形，它显示染料通过小孔扩散的途径。2将卡片纸剪成与培养皿大小一致的圆片，然后在一张卡片纸的中部剪成一正方形大孔，每边长3cm，则面积为9cm2。在另一卡片纸上剪成数个小孔，其总面积与大孔完全相等。为此，将其剪成 9个每边长1cm的正方形小孔，并使其均匀地分布在圆形卡片纸上。再将此卡片纸浸于熔化的石蜡中，取出盖于培养皿上，并用石蜡将边缘封严。于两皿中各加入等量的酒精（或丙酮），将此皿分别置于台天平两边用酒精调节使之平衡。隔1530分钟后，由于小孔具有较高的边缘效应，酒精蒸发较快，因此台天平指针倾向大孔一边，由此可看出孔的

13、总面积虽相等，但酒精通过小孔的散失比大孔要快得多。证明小孔的边缘效应要大，因其周缘长度比大孔大。实验5 单盐毒害及离了间拮抗现象原理离子间的拮抗现象的本质是复杂的，它可能反映不同离子对原生质亲水胶粒的稳定度、原生质膜的透性，以及对各类酶活性调节等方面的相互制约作用，从而维持机体的正常生理状态。仪器药品烧杯 纱布石蜡 0.12mol/L KCl0.06mol/L CaCl2 0.12mol/L NaCl（所用药品均需用AR）操作步骤实验前34天选择饱满的小麦种子100粒浸种，在室温下萌发，待根长1cm时即可用作材料。取4个小烧杯，依次分别倒人不列盐溶液： （1）0.12molL KCI （2）0

14、.06 molL CaCl2 （3）0.12 molL NaCI （4）0.12 molL NaCl 100 ml0.06 molL CaCl2 1 ml十0.12molL KCl 2.2 ml小烧杯用涂石蜡的纱布盖上。挑选大小相等及根系发育一致的小麦幼苗10株或20株，小心种植在纱布盖的孔眼里，使根系接触到溶液，在室温下培育23星期后，即可看出在单盐溶液中，小麦幼苗生长，特别是它们的根部出现畸形。 实验6 植物根系对离子的选择吸收原理 植物根系对不同离子吸收量是不同的，即使是同一种盐类，对阳离子与阴离子的吸收量也不相同。本实验是利用植物对不同盐类的阴、阳离子吸收量不同，使溶液的pH发生改变以

15、说明这一吸收特性。此实验也使我们了解什么是生理酸性盐与生理碱性盐。仪器药品pH计 精密pH试纸移液管 100ml三角烧瓶0.5mg/ml（NH4）2SO4 0.5mg/ml NaNO3 操作步骤1在实验前约23周按实验19方法培养根系完好的小麦（或其他植物）植株。2实验开始时吸取0.5mg/ml浓度的（NH4）2SO4和NaNO3各100ml分别置于两个100ml三角烧瓶中，另一三角烧瓶中放蒸馏水 100ml。用 pH计或精密pH试纸测定以上各溶液和蒸馏水的原始pH值。 3取根系发育完善的、大小相似的小麦3份，每份数株，但数目相等，分别放于上述3个三角烧瓶中，在室温下经2一3小时后*取出植株，

16、并测定溶液的pH值。实验结果按下表记录。 植物从盐溶液中吸收离子后溶液pH值的变化处 理pH值放植株前 放植株后0.5mg/ml（NH4）2SO40.5MG/ML NaNO3蒸馏水注：为了避免根系的分泌作用影响实验结果，故用蒸馏水作对照，将上述pH值变化进行修正，即得真实的pH变化。实验7 钾离子对气孔开度的影响原理保卫细胞的渗透系统歌可由钾离子所调节，无论是环式或非环式光合磷酸化，都可形成ATP。ATP不断供给保卫细胞原生质膜上的钾氯离子交换泵作功，支持保卫细胞逆着离子浓度差而从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫细胞的渗透势，从而使气孔张开。仪器药品显微镜 镊子 温箱载玻片、盖玻片 培养皿0.

17、5%硝酸钾 0.5%硝酸钠操作步骤1配0.5%KNO3及0.5%NaNO3溶液。2在3个培养皿中分别放0.5%KNO3、0.5%NaNO3及蒸馏水各15ml。3撕蚕豆叶表皮若干放入上述3个培养皿中。4培养皿放入25温箱中，使溶液温度达到25。5将培养皿置于人工光照条件下照光半小时。6分别在显微镜下观察气孔的开度。 实验8 植物的元素缺乏症（溶液培养）原理植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质元素，否则植物就不能很好地生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养试验，可以避免土壤里的各种复杂因素。近年来也已应用溶液培养进行无污染蔬菜

18、的栽培生产。仪器药品分析天平 培养缸（瓷质或塑料）鱼缸打气泵 量筒烧杯 移液管按下表分别配制贮备液，所用药品均需为分析纯：药品名称用 量（g/L）Ca（NO3）282.07KNO350.56MgSO4·7H2O61.62KH2PO427.22NaNO342.45MgCl223.81Na2SO435.51CaCl255.50KCl37.28Fe-EDTANa2-EDTA 7.45g,FeSO4·7H2O 5.57g微量元素H3BO3 2.860g,MnSO4 1.015g,CuSO4·5H2O 0.079g,ZnSO4.7H2O0.220G,H2MOO4 0.090

19、g操作步骤1材料准备番茄、蓖麻、小麦、玉米等都作为材料。粒小的种子，从种了带来的营养元素少，缺乏症容易出现，粒大的种子可以在幼苗未做缺元素培养之前，先将胚乳（或子叶）除去，这样也可以加速缺乏症的出现。种子用漂白粉溶液灭菌30分钟，用无菌水冲洗数次，然后放在洗净的石英砂中发芽，加蒸馏水，等幼苗长出第一真叶时待用。2配制缺元素培养液按下表用量配制缺元素培养液：贮备液贮备液（ml）完全-N-P-K-Ca-Mg-S-Fe缺微量元素Ca(NO3)2KNO3MgSO4KH2PO4Fe-EDTA微量元素NaNO3MgCl2Na2SO3CaCl2KCl10101010101010101010101010101

20、0101010101010101010101010101111111111111111010101010102.5配制时先取蒸馏水900ml，然后加入贮备液，最后配成1 000ml，以避免产生沉淀。培养液配好后，用稀酸、碱调节至pH563培养观察先取大小一致的植株，用泡沫塑料包裹茎部，插入培养缸盖的孔中，每孔一株。将培养缸移到温室中，经常注意管理并观察，用蒸馏水补充缸中失去的水分。每隔一定时间（一周左右，随植株大小而定）更换培养溶液，并测定换出溶液的pH。植株长大后要通气，通气可用鱼缸打气泵。注意记录植株的生长情况，各种元素缺乏症的症状及出现的部位。4元素缺乏症检索1老叶受影响。（1）影响遍及

21、全株，下部叶子干枯并死亡。a.植株淡绿色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱缺Nb.植株深绿色，并出现红或紫色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱缺P（2）影响限于局部，有缺绿斑，下部叶子不干枯，叶子边缘卷曲呈凹凸不下。a.叶子缺绿斑有时变红，有坏死斑，叶柄纤弱缺Mgb.叶子缺绿斑，在叶边缘和近叶消耗或叶脉间出现小坏死斑，叶柄纤弱缺Kc叶子缺绿斑，叶子包括叶脉产生大的坏死斑，叶子变厚，叶柄变短缺Zn2幼叶幼叶受影响。（1）顶芽死亡，叶子变形和坏死。a.幼叶变钩状，从叶尖和边缘开始死亡缺Cab.叶基部淡绿，从基部开始死亡，叶子扭曲缺B（2）顶芽仍活着，缺绿或萎蔫而无坏死斑。a.幼叶萎焉，不缺绿，茎尖弱缺Cub.

22、幼叶不发生萎蔫，缺绿。（a）有小坏死斑，叶脉仍绿色缺Mn（b）无坏死斑，叶脉仍绿色缺Fe（c）无坏死斑，叶脉坏死缺S5待植株症状表现明显后，将缺元素培养液换成完全培养液，留下一株继续培养，观察植株症状是否减轻以至消失。其余植株测量根、茎的长度，重量，叶子数目、大小和重量，节数和节间长度，然后在烘箱中烘干，作为实验15、16、17、18的材料，测定植株中的氮，磷，铁，铜的含量。实验9 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酸是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收各利用氮肥有关。它作用于NO-3使还原为NO-3；NO-3+NADH+H+NO-2+NAD+H2O产生的NO-2可以从级织内渗透到外界溶液中

23、，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。NO-2含量的测定用磺胺对氨基苯磺酸胺（sulfanil-amide）比色法。在酸性溶液中磺胺与NO-2形成重氮盐，再与-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5g的NaNO2。仪器药品721型分光光度计 真空泵（或注射器）保温箱 天平真空干燥器 钻孔器三角烧瓶 移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH

24、7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22gKNO3于1 000ml蒸馏水中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。-萘胺试剂：0.2g-萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶角成1 000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1 000ml，此溶液每ml含有NaNO2 10g，用时稀释之。操作步骤1将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水先，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤23次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0

25、.30.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+蒸馏水5ml；（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO

26、-2含量。注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30g 3-磷酸甘油醛或1，6-二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。2NO-2含量的测定保温30分钟的结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测定，比色波长为520nm，记下吸光度或透光率，从标准曲线上查得NO-2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2g或mol表示之。3绘制标准曲线测定NO-2的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1g/ml的NaNO2含量，可于05g

27、/ml浓度范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5g/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置303分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。实验10 叶绿体色素的提取和分离（纸层析法）原理

28、 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。 分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。仪器药品 大试管 台天平 研钵 量筒 烧怀 漏斗 软木层 新华滤纸 丙酮 四氯化碳 无水硫酸钠 碳酸钙 石英砂操作步骤 1称取新鲜叶子2 g，放入研钵中加丙酮 5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加

29、丙酮 5 ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。 2取准备好的滤纸条（2×2 cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，如图7。 3用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次。4在大试管中加入四氯化碳35ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰图到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。5经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿

30、素b。 实验11 植物体色素及其性质 原理 植物色素包括脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞波色素，前者存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素；后者存在于液泡中，特别与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。了解它们的性质有助于对其生理功能的理解。仪器药品 分光计 天平 研钵 分液漏斗 移液管 量筒 吸球 试管 碳酸钙 氢氧化钾 丙酮 乙醚 甲酸 盐酸 醋酸铜操作步骤 1叶绿体色素的提取 取菠菜（或其他植物）叶子2g，放在研钵中，加石英砂和碳酸钙少许，丙酮约 5 ml，研磨成匀浆，再加丙酮15 ml，则得深绿色提取液，用漏斗过滤之，即为色素提取液。 2叶绿素的荧光现象 取上述色素丙酮提取液少许于试管

31、中，用反射光和透射光，观察提取液的颜色有无不同，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色 3光对叶绿素的破坏作用取上述色素丙酮提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹），另1支试管放在强光下（太阳光）经2一3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？ 4，铜在叶绿素分子中的替代作用 取上述色素丙酮提取液少许于试管中，1滴1滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体1小块，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。 5黄色素和绿色素的分离 取上述色素丙酮提取液 10 ml，加到盛有

32、 20 ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入20ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液12次。然后于色素乙醚溶液中加入5ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置10分钟，再加蒸馏水约 10 ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。 6观察色素溶液的吸收光谱（1）调节分光计，观察电灯光的光谱。 （2）观察色素丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释1倍比较之。 （3）观察黄色素乙醚溶液，用乙醚将溶液稀释1倍比较之。 （4）观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释1倍比较之。（

33、5）观察被光破坏的色素丙酮溶液，试与（2）作比较。（6）观察被铜取代了镁的色素溶液。实验12 叶绿素 a和b含量的测定（分光光度法）原理 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代教方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图9叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在 663nrn，叶绿素 b在 645nrn，吸收曲线彼此又在重叠。根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间

34、有如下的关系（参阅实验86）：A1=Ca·ka1+Cb·kb1A2=Ca·ka2+Cb·kb2式中：Ca为组分a的浓度，gL。 Cb为组分b的波度，gL。 Al为在波长1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。 A2为在波长2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。 kal为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为 1g/L时，于波长1时的吸光度A值。 Kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1gL时，于波长2时的吸光度A值。ka2为组分a（浓度为1 g/L）在波长2时的吸光度A值。 Kb1为组分b（浓度为1 g/L）在波长1时的

35、吸光度A值。从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：波长（nm）叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：A663=82.04×Ca+9.27×CbA645=16.75×Ca+45.60×Cb经过整理之后，即得到下式：Ca=0.012 7A6632.69A645 (3)Cb=22.9A6454.68A663 (4)CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 (5)（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上面（3）、（4）、（

36、5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素ab值小于1，这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650670nm和630650nm之间，每隔12nm测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰

37、的波长。如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a

38、和b。实验13 叶绿体的分离原理分离叶绿体应在等渗溶液中制备，以减少渗透压对叶绿体的伤害，仔细研磨，然后离心取得叶绿体的悬浮液。整个过程应在05下进行，所有提取物、溶液和材料，也应保存在该温度下，分离后活性测定工作应尽快进行。仪器药品离心机 天平容量瓶 量筒移液管 研钵烧杯 纱布0.35mol/L NaCl 35m mol/L NaCl 10m mol/L Tris-HCl缓冲剂，Ph7.8（见附表2）操作步骤1最好在晴天上午10时左右，选取健康的菠菜叶（也可用豌豆叶），洗净，擦干，去叶柄及主脉，称取10g鲜重在冰浴中研磨。2研磨时加入20ml 0.35mll/L NaCl，2ml 10 mm

39、ol/L Tris-HCl缓冲液，以及少量石英砂。3研磨成匀浆后，用4层纱布过滤于烧杯中。4滤液用1 000r/min离心2分钟，弃去沉淀，收集上清液。5上清液用3 000r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀即是叶绿体。6将沉淀分成2份，分别加入0.35mol/L NaCl溶液和35mmol/L NaCl溶液各10 ml，制成悬液，使叶绿体分别处于等渗和低渗溶液中，以获得完整叶绿体和破碎叶绿体。保存在冰箱中，用于实验41的测定。实验14 离体叶绿体对染料的还原作用（希尔反应）原理离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂存在下，例如染料二氯靛酚（DCPIP），当照光时，可以使水光解释放氧气，同时使染料

40、还原，结果染料从原来的蓝色变为粉红色至无色。此反应为希尔所发现，故常称为希尔反应。可用分光光度计测定反应前后染料吸光度A的变化，变化在45分钟内呈线性关系。仪器药品721型人光光度计 试管架烧杯 容量瓶移液管 试管100m mol/L磷酸缓冲液，pH7.3（见附表2）0.3m mol/L 2，6二氯靛酚钠；称取8.7mg二氯靛酚钠，加蒸馏水定容至100ml（如药品纯度低，可适当提高浓度）。操作步骤1加样取干净试管6支，分为两组，并分别编成1、2、3号，然后按下表加入试剂。管号磷酸缓冲液（ml）叶绿体悬液（ml）煮沸（分钟）二氯靛酚（ml）完整叶绿体1239.49.49.90.20.20.250

41、.50.5叶绿体碎片1239.49.49.90.10.10.150.50.5注：（1）叶绿体悬液为实验40所制备。（2）2号管加叶绿体悬液后于沸水浴上煮5分钟，然后用蒸馏水补足丧失的水分。（3）3号管为比色时调节零点用。（4）各试管都在最后加入二氯靛酚以开始反应，并立即摇匀进行比色测定，以代表作用时间为0。各管在加染料之前保存在冰浴中。2比色当加入染料后立即摇匀倒入相应的比色杯中，迅速测定吸光度，波长为620nm，此即代表0时的吸光度。然后将比色杯置于离150W灯光约60cm处照光，每隔1分钟快速读下吸光度的变化，连续进行5、6次读数，严格控制照光时间。3将结果以每分钟A620的变化量（A62

42、0/min）为纵坐标，以时间（分钟）为横坐标作图。实验15 改良半叶法测定大田光合强度原理 改良半叶法系将植物称叶片的一部分遮光或取下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合作用产物的产量，并通过一定的计算可得到光合作用强度。仪器药品 分析天平 烘箱 剪刀 称量皿 刀片 金属模板 纱布 锡纸 三氯乙酸操作步骤 1选择测定样品 在田间选定有代表性植株叶片（如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件等）20张，用小纸牌编号。 2叶子基部

43、处理 为了不使选定叶片中光合作用产物往外运，而影响测定结果的准确性，可采用下列方法进行处理： （1）可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片，可用刀片将时柄的外皮环割约0.5 cm宽。 （2）如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子。将叶子基部烫伤一小段即可（一般用90以上的开水烫20秒）。 （3）由于棉花叶柄木质化程度低，叶柄易被折断。用开水烫，又难以掌握烫伤的程度，往往不是烫得不够便是烫得过重而叶片下垂，改变了叶片的角度。因此可改用化学方法来环割，选用适当浓度的三氯乙酸，点涂叶柄以阻止光合产物的输出。三氯乙酸是一种强烈

44、的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死，而起到阻止有机养料运输的作用。三氯乙酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异。以能明显灼伤叶柄，而又不影响水分供应，不改变叶片角度为宜。一般使用5%三氯乙酸。 3剪取样品 叶基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始光合作用测定。一般按编号次序分别剪下对秋叶片的一半（主脉不剪下），按编号顺序夹于湿润的纱布中，贮于暗处。过4一5小时后，再依次剪下另外半叶，同样按编号夹于湿润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持一致，使各叶片经历相等的照光时数。 4称重比较 将各同号叶片之两半按对应部位叠在一起，在无粗叶脉处放上已知面积（如棉花可用1.5×2cm）的金属

45、模板，用刀片沿边切下两个叶块，分别置于照光及暗中的两个称量皿中，8090下烘至恒重（约5小时），在分析天平上称重比较。 5计算结果叶片干重差之总和（mg）除以叶面积（换算成dm2，1dm2=100cm2）及照光时数，即得光合作用强度，以干物质，mg/（dm2·b）表示之。计算公式如下：光合作用强度=由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数1.5，得二氧化碳同化量，单位为CO2，mg/(dm2·h)。实验16 淀粉的合成淀粉磷酸化酶原理植物的组织中有一种淀粉磷酸化酶，能利用1-磷酸葡萄糖合成淀粉，生成的淀粉可用I2-KI染色检出。1-磷酸葡萄糖淀粉仪器药

46、品台天平 离心机水浴锅 研钵移液管 1%1-磷酸葡萄糖0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲液，pH6.5，（见附表2）。I2-KI溶液：溶液1.5gKI于少量蒸馏水中，加入结晶碘0.3g，待溶解后，稀释100ml。操作步骤1取马铃薯块茎一个，削去皮，切成小块，称取10g，于研钵中加石英砂少许，用10ml 0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲溶液研磨成匀浆。2用纱布滤取汁液，于3 500 r/min离心15分钟，以除去淀粉，即为粗制酶液。3取小试管2支，分别加入1%1-磷酸葡萄糖1ml，再于1管中加入1ml粗制酶液，另1管中加入已经煮沸15分钟的粗制酶液。摇匀试管，立即各

47、吸取1滴于白瓷板上，分别加1滴I2-KI溶液，测试有无淀粉存在。4以后每隔10分钟，取试管中混合液1滴，检查淀粉的生成。比较煮沸能否使酶失活？实验17 植物呼吸强度的测定(小篮子法)原理利用Ba（OH）2溶液吸收呼吸过程中释放的CO2，实验结束后，用草酸溶液滴定残留的Ba（OH）2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。仪器药品广口瓶 温度计酸式滴定管 干燥管尼龙网制小篮0.05 mol/L Ba（OH）2指示剂：0.1%麝香草酚酞酒精溶液（见附录表4）。1/44 mol/L草酸溶液：准确称取重结晶的草酸H2C2O4·2H2O2.8652g，溶于蒸馏水

48、，配成1 000ml，每ml溶液相当于1mg的CO2。操作步骤1取500ml广口瓶一个，装配一只三孔橡皮塞，一孔插入盛碱石灰的干燥管，以吸收空气中的CO2，保证进入呼吸瓶的空气无CO2，一孔插入温度计，另一孔直径约1cm左右供滴定用，滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，用以盛实验材料，整个装置如图所示。2称取萌发的小麦或水稻种子15g，装于小篮内，将小篮挂在广口瓶内，同时加0.05mol/L Ba（OH）2溶液25ml于广口瓶内，立即塞紧瓶塞，并用熔化的石蜡密封瓶口，防止漏气。每10分钟左右，轻轻地摇动广口瓶，破坏溶液表面的BaCO3薄膜，以利对CO2的吸收。31小时后，小心打开瓶

49、塞，迅速取出小篮，加入2滴指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞，将滴定管插入小孔中，用1/44 mol/L的草酸滴定，直到蓝绿色转变成无色为止。记录滴定所耗用的草酸溶液的ml数。4另取用沸水煮死的种子为材料，作同样测定，以此作为对照。5计算式中 V0为煮死的种子，所耗用草酸的ml 数， V1为发芽的种子，所耗用草酸的ml 数。 实验18 过氧化物酶活性的测定（比色法）原 理 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。 仪器 药品 721型分光光度计 离心机 秒表 天平 研钵 磁力搅拌器 愈创木酚

50、 30过氧化氢 20 mmo1L KH2LPO4 100mmo1/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2） 反应混合液：100 mmo1L磷酸缓冲液（pH 60）50 ml于烧杯中，加入愈创木酚281，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30%经过氧化氢191，混合均匀，保存于冰箱中。操作步瞩 1称取植物材料1g，加 20 mmolL KH2PO45 ml，于研钵中研磨成匀浆，以 4 000rmin 离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5 ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液贮于冷处备用。 2取光径 Icm比色杯2只，于 1只中加入反应混合液3m1，KH2PO4 1m1，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长 470nm下进行。3. 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示之。蛋白质含量测定参阅实验56。 实验19 多酚氧化酶活