氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

1、氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响         11-01-10 10:53:00     作者：杨益民    编辑：studa20【摘要】  目的 研究氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响。方法 将32只兔子随机分组，正常组未采取任何处理，氨基胍组及模型组行右后肢伸直位管型石膏固定造模, 氨基胍组腹腔内注射100mg/(kg·d)氨基胍硫酸盐溶液，模型组每天腹腔内注射相同体积的生理盐水。分别于4周和8周处死动

2、物，留取标本观察软骨大体形态,切片HE染色观察镜下形态，免疫组化检测iNOS表达，TUNEL法原位检测凋亡。结果 与模型组相比，氨基胍组在大体形态、HE切片镜下形态接近于正常组，组化染色显示iNOS表达阳性细胞数显著减少(P<0.05)，TUNEL法原位检测显示凋亡阳性细胞数显著减少(P<0.05)。结论 氨基胍能有效减少iNOS表达和软骨细胞的凋亡，延缓OA的病情发展。 【关键词】  氨基胍 骨关节炎 软骨细胞 凋亡 兔 诱导型一氧化氮合酶ABSTRACT: Objective  To observe the effect of aminoguanidine

3、by intraperitoneal injection on apoptosis of chondrocyte with osteoarthritis. Methods  Totally 32 rabbits were divided into 3 groups at random. Both the experiment and the model groups were fixed by plaster cast in the right hind straighten limb, while the control group received no treatment. T

4、he experiment groups were injected with aminoguanidine in abdominal cavity, 100mg/(kg·d), and the control groups were injected the same voluminal normal saline in abdominal cavity. At the 4th week, we killed 4 rabbits from the normal group, and 6 from the control group and the experiment group,

5、 respectively. At the 8th week, we put the rest to death. We drew the materials from each sample for pathological observation on the whole and under the light microscope by HE and immunohistochemical staining, and counted apoptosis cells by TUNEL for statistical analysis. Results  Compared with

6、 the control group, the experiment group was more similar to the normal group in general observation and optical microscope observation by HE staining. Both iNOS positive expression cell by immunohistochemical staining and apoptosis cell calculation by TUNEL of the experiment group were fewer than t

7、hose of the control group(P<0.05). Conclusion  Aminoguanidine injected in abdominal cavity can depress the production of iNOS, decrease apoptosis of the cartilage cell, and delay or prevent progression of OA.KEY WORDS: aminoguanidine; osteoarthritis; chondrocyte; apoptosis; rabbit; iNOS骨性关节炎

8、(osteoarthritis, OA)是一种老年常见慢性疾病，严重影响患者的生活质量，其重要的病理学特征是关节软骨的降解(包括软骨细胞的数量减少和细胞外基质降解)。早期缺乏有效的特异性治疗方法，往往因症状加重而需行人工关节置换术。现研究证明，OA患者体内一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度升高。过高的NO可影响关节软骨的代谢，造成软骨细胞凋亡增多。氨基胍(aminoguanidine, AG)是一种选择性的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)抑制剂，本实验使用AG干预兔OA模型，观察关节软骨的形态变化及软骨细胞凋亡，旨在

9、探讨治疗OA的新途径。1  材料与方法1.1  材料  健康成熟日本大耳白兔32只，体重2.2-2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。氨基胍硫酸盐由美国Sigma公司购得，iNOS免疫组化染色一抗购自博士德生物工程有限公司，二抗及碱性磷酸酶购自北京鼎国生物技术公司，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自美国罗氏公司。1.2  实验分组  32只兔子随机分为正常组、模型组和氨基胍组。后两组行右后肢伸直位管型石膏固定造模,自由活动，正常喂养。氨基胍组腹腔内注射氨基胍硫酸盐溶液100mg/(kg·d)，模型组每天腹腔内注射相

10、同体积的生理盐水，正常组不予任何处理。密切观察动物，有石膏松动迹象时，予以修复，牢靠固定。1.3  形态观察及HE染色  4、8周时采用空气栓塞法分别处死各组半数动物，取右后肢股骨髁进行大体标本病理学观察后，用40g/L多聚甲醛固定，100g/L EDTA脱钙液脱钙，制备切片，HE染色。1.4  TUNEL法检测细胞凋亡  切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢处理10min，用蛋白酶K于37消化15min，滴加25L的TUNEL反应混合溶液(含末端脱氧核糖核酸转移酶TDT及含有核苷酸混合液)，在湿盒中37孵育60min，DAB显色，苏木

11、素复染，封片。阳性对照：在切片置TUNEL反应混合溶液前，先在200ng/mL DNase(DNA聚合酶)溶液中37下反应15min；阴性对照标记时不加TDT，其余步骤相同。1.5  iNOS的免疫组化染色  切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢甲醇冲洗，磷酸盐缓冲液冲洗，1.25g/L胰蛋白酶消化。加入10mL/L牛血清白蛋白，20孵育15min。第一抗体在4下孵育18h，第二抗体孵育30min。加标记液(碱性磷酸酶)反应30min，加显色液反应30min，细胞核用苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。1.6  切片观察及统计学处

12、理  光学显微镜10×10倍视野下，于软骨细胞层中随机选取4个视野，分别统计100个细胞内平均iNOS表达阳性细胞数和凋亡阳性细胞数。应用SPSS10.0统计软件，采用方差分析及t检验，检验水准为0.05。2  结果2.1  大体标本观察  正常组关节软骨呈浅蓝白色，半透明，表面光滑，边缘规整，无缺损及裂隙，有弹性，光泽度好，4周和8周无差异。氨基胍组4周时软骨表面呈蓝白色，颜色较深，表面光滑，有光泽，未见缺损及裂隙；8周时软骨表面呈蓝白色，基本光滑，有光泽，未见缺损及裂隙。模型组4周时软骨表面呈淡黄白色，透明度差，表面不光滑、粗糙，可见软骨面

13、的缺损；8周时软骨表面呈黄白色，色泽暗淡，表面粗糙，缺乏弹性，部分标本有较大的缺损和裂隙。2.2  光学显微镜观察  正常组软骨表面光滑，细胞排列规整，层次清楚，细胞无增生肥大，基质染色均匀，未见血管分布。氨基胍组4周时软骨表面光滑，无裂隙，软骨细胞增生、肥大，排列尚好，基质染色基本均匀，未见血管翳生成；8周时软骨表面尚光滑，软骨细胞增生、肥大，层次增厚，排列紊乱，有细胞簇聚现象，深层有血管增生，潮线模糊。模型组4周时软骨表面不光滑，存在局部小凹陷，软骨细胞增生、大小不等，有簇聚现象，排列紊乱，可见灶性溶解、坏死，软骨厚度变薄，潮线前移、紊乱，部分消失，有血管翳生成；8周时

14、软骨表面局部凹凸不平，存在缺损及裂隙，软骨细胞减少，大小不等，簇聚现象明显，可见灶性坏死。软骨厚度明显变薄，基质异染，有较多血管位于深层，潮线多数消失(图1)。图1  不同组兔关节软骨HE染色（略）Fig.1 HE staining of rabbit arthrodial cartilage in different groups (×100)A: normal group; B: model group, 8 weeks; C: aminoguanidine group, 8 weeks2.3  凋亡阳性细胞计量分析  凋亡阳性细胞为散在分布，胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色，凋亡阴性细胞胞核呈蓝色。正常组仅在关节软骨的深层有少量的凋亡阳性细胞散在分布；氨基胍组和模型组凋亡阳性细胞增多，分布于各层(图2)。4周时凋亡阳性细胞数正常组为(4.00±2.58)%,模型组为(21.83±3.06)%，氨基胍组为(15.83