桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、 增殖和细胞周期的影响

1、桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、 增殖和细胞周期的影响                作者：臧宁, 曾耀英, 黄秀艳, 王通, 叶雪仪, 周建国, 王会营 【关键词】  桑色素;,T细胞活化;,增殖;,细胞周期The effect of morin on activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitroAbstract  AIM: To di

2、scover the effects of morin on the activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitro. METHODS: Murine lymph nodederived T lymphocytes were separated and stimulated with concanavalin A (ConA) and different experimental groups were set by cocultured with morin of different final

3、 concentration. Flow cytometry (FCM) was used to detect the activation, proliferation carboxylfluorescein diacetate, succinimide ester (CFDASE) staining and cellcycle propidium iodide(PI) staining of T cells. RESULTS: After 6 h time of culture in vitro, the  rate of CD69+ T cells in control gro

4、up was (2.97±0.12)%, while it was significant higher in ConA group(72.52±0.66)% (P0.01). Morin could downregulate this rate at final concentration being 25, 50 and 100 mol/L, with a peak at 100 mol/L morin(48.95±0.81)% (P0.01). CFDASE staining showed that at 48 h and 72 h, the prolife

5、ration indexes (PI) of T cells in ConA group were (1.58±0.04) and (1.95±0.02), respectively. Morin could significantly decrease the PI value at all experimental concentration, with the peak effect at 100 mol/L morin, which the PI for 48 h was (1.02±0.02) and (1.03±0.01) for 72 h

6、(P0.01). FCM analysis of PI staining implied that the percentage of S phase cells in ConA group was (27.05±0.39)%, significantly higher than that in control group (5.10±0.07)%; and the 25 and 50 mol/L morin groups showed higher S phase cell rates. CONCLUSION: Morin can significantly inhibi

7、t ConA stimulated activation and proliferation of murine T lymphocytes, in which the S phase lagging may serve as one of the major mechanisms. Keywordsmorin; T cells activation; proliferation; cell cycle摘 要  目的: 研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、 增殖和细胞周期的影响。方法: 以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞, 再以不同终浓度的morin

8、与T细胞共培养, 利用流式细胞术(FCM), 检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达, 以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDASE)染色检测T细胞的增殖; 以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果: 小鼠T细胞培养6 h后, 未经ConA刺激的对照组中CD69+T的细胞比率为(2.97±0.12)%, 经ConA刺激的CD69+T细胞的比率明显增高, 达到(72.52±0.66)%, 与对照组相比差别明显(P0.01)。终浓度为25、 50、 100 mol/L的morin均下调CD69+T细胞的比率, 其中, 100 mol/L的morin抑制作用最强, 为(

9、48.95±0.81)%, 与对照组比较具有统计学意义(P0.01)。CFDASE染色分析显示, ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数（PI）分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02), 各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖, 具有明显地抑制作用, 以100 mol/L的morin抑制作用最明显。培养48  h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、 培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01), 与相应时间的对照组比较, 均有统计学意义(P0.01)。PI染色后流式细胞术分析

10、的结果表明, ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%, 显着高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。 结论:  Morin可显着抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖; 其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。 关键词桑色素; T细胞活化; 增殖; 细胞周期桑色素(morin)化学名称为(3,5,7,2,4五羟黄酮), 是黄酮类化合物中的一种, 为从黄桑木、 桑橙树和许多中草药中提取的一种浅黄色色素1。morin分子的结构特点是含氧的杂环连接两个芳香族环, 具有抗炎、 抗肿瘤及抗氧化等作用。Fang等研究

11、表明, morin可抑制Th1细胞产生的IL12和经LPS/IFN活化的巨噬细胞产生的NO, 提示morin具有抑制固有免疫的作用, 然而关于morin使T细胞活化、 增殖作用的研究, 国际、 国内罕见报道。因此, 我们先用刀豆蛋白A(ConA)使T细胞活化、 增殖后, 再以morin进行刺激, 探讨其对T细胞活化、 增殖的影响, 以为其临床应用提供试验依据。1  材料和方法1.1  材料  清洁级BALB/c近交系小鼠, 雄性, 68 周龄, 质量(20±2) g, 购自广东省实验动物中心。morin、 ConA、 碘化丙锭(propidium iod

12、ide, PI)、 L谷氨酰胺、 巯基乙醇, 均购自美国Sigma公司。RPMI1640培养基、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为美国GibcoBRL公司产品。羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimide ester, CFDASE)购自美国InvitrogenMolecular Probes公司。PE抗CD3单克隆抗体(mAb)及FITC抗CD69 mAb购自美国BDPharMingen公司。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。1.2  方法1

13、.2.1  小鼠淋巴细胞悬液的制备  将BALB/c小鼠断髓处死, 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结, 置于盛有预冷的PBS的无菌平皿中, 去掉被膜, 通过200目尼龙网过滤。收集细胞, 加入到冷PBS中以250 g离心5 min, 洗涤细胞2次, 再悬于PBS中。1.2.2  T细胞早期活化标志CD69表达的检测  采用直接免疫荧光标记法染色。设5个试验组: 对照组(未加ConA和药物刺激), ConA组,（ConA+morin 25 mol/L）组, （ConA+morin 50 mol/L）组, （ConA+morin 1

14、00 mol/L）组, 各组细胞培养6 h后, 取细胞悬液并离心浓缩至50 L, 加入浓度为0.2 mg/mL的PE抗小鼠CD3 mAb和FITC抗CD69 mAb各10 L, 混匀后, 室温避光30 min。加入冷PBS中, 以250 g离心5 min, 再重悬于300 L的PBS中, 立即用流式细胞术进行检测。1.2.3  T细胞增殖的CFDASE染色检测  小鼠淋巴细胞按文献的方法进行CFDASE染色, 将CFDASE用PBS稀释成2 mol/L的工作液, 再以PBS调整细胞悬液的密度为2×1010/L, 加入等体积的CFDASE染液(终浓度为1mol/L)

15、, 充分混匀后, 在室温条件下轻轻振荡10 min。然后加入冷PBS中, 以250 g离心5 min, 洗涤细胞2次, 接种于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养基中, 并调整细胞的密度为2×109/L, 于37、 50 mL/L CO2条件下培养。分别收获培养48 h、 72 h的细胞, 加入浓度为0.2 mg/L的PE抗CD3 mAb, 离心洗涤细胞1次, 将细胞重悬于300 L的PBS中, 用流式细胞术进行检测。1.2.4  细胞周期的分析  离心收获培养48 h的细胞, 以700 mL/L乙醇固定后, 加入PI溶液(50 mg/L PI、

16、0.1% Triton X100、 0.1 mmol/L EDTA及50 mg/L RNase A)染色30 min, 然后用流式细胞术分析DNA的含量。1.2.5  流式细胞术分析  所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中, 划出淋巴细胞区R1, 在横坐标为PE抗CD3 mAb, 纵坐标为SSC的图中, 划出CD3+细胞区R2, 然后对淋巴细胞上的CD69FITC及CFDASE的荧光强度进行检测。其中CFDASE、 FITC为荧光1(FL1), PE为荧光2(FL2)。每管细胞悬液样品检测

17、10000个细胞, 获得的数据用CELLQuest及ModFit L T 3.2软件进行分析。1.2.6  统计学处理  全部数据使用均Excel进行处理, 数据以x±s表示,   两组间的比较采用配对t检验。2  结果2.1  Morin对T细胞CD69表达的影响  小鼠T细胞培养6 h后, ConA刺激组T细胞的活化率为(72.52±0.66)%与对照组(未经ConA刺激的T细胞)T细胞的活化率(2.97±0.12)%相比较, 差异显着 (P0.01)。于培养的T细胞中, 加入25 mol/

18、L、 50 mol/L、  100 mol/L的morin与ConA共孵育后, 均可明显抑制ConA介导的CD69分子的表达, 其中, 100 mol/L的morin的抑制率最强, 检测的T细胞中CD69+ T细胞的比率为(48.95±0.81)%, 与ConA组T细胞的活化率(72.52±0.66)%相比较差异显着(P0.01, 图1)。图1  Morin对ConA激活的T细胞表面CD69分子表达的流式细胞术分析（略）Fig 1  Analysis of morin on CD69 expression on T cells activate

19、d with ConA by flow cytometry2.2  Morin对小鼠T细胞增殖的影响  CFDASE染色后, 在荧光1通道(FL1)中可检测出均一染色的细胞群。根据细胞分裂1次, 其荧光强度倍减一半的原理, 动态追踪了T细胞增殖的情况。用ModFit L T 3.2软件拟合后, 得到增殖的T细胞各代的百分率及增殖指数(PI)。如图2A、 2B所示, 细胞培养48及72 h后, ConA刺激组的细胞分别出现3、 4个子代峰,  加入25、 50及100 mol/L的morin后, 细胞分裂的代数及PI值均递减(图2C), 其中, 以100 mol/L

20、 morin加药组的抑制作用最明显, 培养48 h的T细胞的PI为(1.02±0.02), 培养72 h的T细胞的PI为(1.03±0.01)。与相应时点ConA刺激组T细胞的PI比较有统计学意义(P0.01, 图2)。图2  Morin对ConA刺激的T细胞增殖的影响（略）Fig 2  Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConAA: Representative results for 48 h incubation; B: Representative result

21、s for 72 h incubation; C:  Statistic results of PI, aP0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).2.3  Morin 对小鼠T细胞周期的影响  未经ConA刺激的对照组T细胞主要处于G0/G1期; 经ConA刺激后48 h, 与对照组相比较, 处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加, 分别为(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各剂量的morin共孵育组其G2/M期T细胞的比率均明显减少, 其中100 mol/L的mo

22、rin共孵育组T细胞的比率最少, 为(8.38±0.43)%; 25 mol/L及50 mol/L的morin共孵育组S期T细胞的比率明显增加, 分别为 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 与ConA组相比较具有统计学意义(P0.01, 表1)。表1  Morin对ConA刺激后培养48 h 的T细胞细胞周期的影响（略）Tab 1  The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 haP0.05, bP0.01 vs Co

23、nA stimulation group.3  讨论研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬细胞的吞噬活性及IL12产生, 因此, morin对巨噬细胞吞噬活性和释放IL12的抑制作用, 可能会下调T细胞介导的细胞免疫应答, 但morin是否直接影响T细胞的活化、 增殖有待阐明。本研究以ConA刺激T细胞活化、 增殖后, 用FCM检测了T细胞早期活化标志CD69分子的表达和T细胞的增殖指数(PI)及各代细胞的百分率。研究结果显示, 各浓度的morin对上述指标均有显着地抑制作用, 提示其对T细胞活化的影响可能是通过抑制ConA与细胞膜表面TCR/CD3地交联而激活早期活化相关的蛋

24、白酪氨酸激酶(PTK)Fyn和Lck的活性, 干扰了早期活化事件有关。另外, 也可能是由于对CD69等早期活化抗原表达的抑制而干扰了随后的活化事件, 从而抑制了T细胞的增殖反应。本研究是体外试验, 与Fang等的体内试验用药方法(胃饲给药)不同, 药物浓度比Verbeek等所用的浓度相比较高, 所以有明显的抑制效应。Morin具有抗菌、 抗肿瘤作用。Morin对金黄色葡萄球菌、 杆菌和黄色微球菌等都有抗菌作用10,   其抗菌机制主要表现为干扰细菌的DNA的合成11、 抑制细菌代谢相关的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和复制型DNA解旋酶RepA的双链DNA解旋活性12等。

25、Hsiang等1研究发现, morin的抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 与本研究中morin对T细胞周期影响的结果类似, 提示其可能是通过抑制P38激酶途径而干扰AP1活性, 使之不能发挥作用所致。此外, morin还可通过逆转药物外流运载体P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)而引起多药耐药效应, 增加抗肿瘤药物在过表达Pgp的肿瘤细胞内蓄积而发挥抗肿瘤作用13。药物发挥抗菌、 抗肿瘤的作用, 并不一定与适应性免疫必然相关, 因此本研究的结论中得出的morin对T细胞活化、 增殖的抑制作用与其抗菌、 抗肿瘤作用并无矛盾。同种异基因移植排斥反应, 主要是受者的T细胞介导的移植

26、抗原特异性免疫应答。经典的免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)是通过阻断IL2依赖的T细胞生长和分化而发挥免疫抑制作用, 从而减轻排斥反应的程度, 延长移植物的存活时间。morin能抑制T细胞活化、 增殖, 并将其阻滞于S期, 提示其也是一种有效的免疫抑制剂, 有可能用于治疗移植排斥反应。此外, Fang等的研究表明, morin与CsA可能在药物代谢和药效方面的相互作用而产生一种互补性效应, 即morin不改变被CsA抑制的Th1型免疫应答, 但可通过显着减少组织中CsA的浓度而减轻CsA对正常组织的毒性作用, 提示在应用morin治疗移植排斥方面具有光明的前景。morin能诱导肿瘤细胞在S期中阻

27、滞, 及逆转Pgp引起多药耐药效应, 可以用来治疗由于长期使用抗肿瘤药物而发生耐药现象的肿瘤患者, 或者是应用于器官移植术后的肿瘤病人有肿瘤复发的危险, 既需要使用免疫抑制剂抑制排斥反应又需要抗肿瘤治疗时的情况。morin的免疫药理机制值得进一步研究。 参考文献:1 Hsiang CY, Wu SL, Ho TY. Morin inhibits 12Otetradecanoylphorbol13acetateinduced hepatocellular transformation via activator protein 1 signaling pathway and cell cycle

28、 progressionJ. Biochem Pharmacol, 2005, 69(11): 1603-1611. Galvez J, Coelho G, Crespo ME, et al. Intestinal antiinflammatory activity of morin on chronic experimental colitis in the ratJ. Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(12): 2027-2039. Brown J, OPrey J, Harrison PR. Enhanced sensitivity of human or

29、al tumours to the flavonol, morin, during cancer progression: involvement of the Akt and stress kinase pathways？J. Carcinogenesis, 2003, 24(2): 171-177. Kitagawa S, Sakamoto H, Tano H. Inhibitory effects of flavonoids on free radicalinduced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobinJ. Chem

30、Pharm Bull (Tokyo), 2004, 52(8): 999-1001. Fang SH, Hou YC, Chao PD. Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions of morin and cyclosporineJ. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 205(1): 65-70. 肇静娴, 曾耀英, 何贤辉. 活体染料CFDASE在淋巴细胞增殖研究中的应用J. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19(2): 109-111. Fulcher D, Wong S. Carboxyfluoresc

31、ein succinimidyl esterbased proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratoryJ. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564. Fang SH, Hou YC, Chang WC, et al. Morin sulfates/glucuronides exert antiinflammatory activity on activated macrophages and decreased the incidenc

32、e of septic shockJ. Life Sci, 2003, 74(6): 743-756. Verbeek R, Plomp AC, van Tol EA, et al. The flavones luteolin and apigenin inhibit in vitro antigenspecific proliferation and interferongamma production by murine and human autoimmune T cellsJ. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4): 621-629.10 Rauha JP, R

33、emes S, Heinonen M, et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compoundsJ. Int J Food Microbiol, 2000, 56(1): 3-12.11 Arima H, Ashida H, Danno G. Rutinenhanced antibacterial activities of flavonoids against Bacillus cereus and Salmonella enteritid

34、isJ. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66(5): 1009-1014.12 Xu H, Ziegelin G, Schrder W, et al. Flavones inhibit the hexameric replicative helicase RepAJ. Nucleic Acids Res, 2001, 29(24): 5058-5066.13 Zhang S, Morris ME. Effects of the flavonoids biochanin A, morin, Phloretin, and Silymarin on PGlycop

35、roteinmediated transport?J. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 304(3): 1258-1267.         2  结果2.1  Morin对T细胞CD69表达的影响  小鼠T细胞培养6 h后, ConA刺激组T细胞的活化率为(72.52±0.66)%与对照组(未经ConA刺激的T细胞)T细胞的活化率(2.97±0.12)%相比较, 差异显着 (P0.01)。于培养的T细胞中, 加入25 mol/L、 50 m

36、ol/L、  100 mol/L的morin与ConA共孵育后, 均可明显抑制ConA介导的CD69分子的表达, 其中, 100 mol/L的morin的抑制率最强, 检测的T细胞中CD69+ T细胞的比率为(48.95±0.81)%, 与ConA组T细胞的活化率(72.52±0.66)%相比较差异显着(P0.01, 图1)。图1  Morin对ConA激活的T细胞表面CD69分子表达的流式细胞术分析（略）Fig 1  Analysis of morin on CD69 expression on T cells activated with

37、ConA by flow cytometry2.2  Morin对小鼠T细胞增殖的影响  CFDASE染色后, 在荧光1通道(FL1)中可检测出均一染色的细胞群。根据细胞分裂1次, 其荧光强度倍减一半的原理, 动态追踪了T细胞增殖的情况。用ModFit L T 3.2软件拟合后, 得到增殖的T细胞各代的百分率及增殖指数(PI)。如图2A、 2B所示, 细胞培养48及72 h后, ConA刺激组的细胞分别出现3、 4个子代峰,  加入25、 50及100 mol/L的morin后, 细胞分裂的代数及PI值均递减(图2C), 其中, 以100 mol/L morin加

38、药组的抑制作用最明显, 培养48 h的T细胞的PI为(1.02±0.02), 培养72 h的T细胞的PI为(1.03±0.01)。与相应时点ConA刺激组T细胞的PI比较有统计学意义(P0.01, 图2)。图2  Morin对ConA刺激的T细胞增殖的影响（略）Fig 2  Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConAA: Representative results for 48 h incubation; B: Representative results for 7

39、2 h incubation; C:  Statistic results of PI, aP0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).2.3  Morin 对小鼠T细胞周期的影响  未经ConA刺激的对照组T细胞主要处于G0/G1期; 经ConA刺激后48 h, 与对照组相比较, 处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加, 分别为(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各剂量的morin共孵育组其G2/M期T细胞的比率均明显减少, 其中100 mol/L的morin共孵育组

40、T细胞的比率最少, 为(8.38±0.43)%; 25 mol/L及50 mol/L的morin共孵育组S期T细胞的比率明显增加, 分别为 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 与ConA组相比较具有统计学意义(P0.01, 表1)。表1  Morin对ConA刺激后培养48 h 的T细胞细胞周期的影响（略）Tab 1  The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 haP0.05, bP0.01 vs ConA stim

41、ulation group.3  讨论研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬细胞的吞噬活性及IL12产生, 因此, morin对巨噬细胞吞噬活性和释放IL12的抑制作用, 可能会下调T细胞介导的细胞免疫应答, 但morin是否直接影响T细胞的活化、 增殖有待阐明。本研究以ConA刺激T细胞活化、 增殖后, 用FCM检测了T细胞早期活化标志CD69分子的表达和T细胞的增殖指数(PI)及各代细胞的百分率。研究结果显示, 各浓度的morin对上述指标均有显着地抑制作用, 提示其对T细胞活化的影响可能是通过抑制ConA与细胞膜表面TCR/CD3地交联而激活早期活化相关的蛋白酪氨酸激酶(

42、PTK)Fyn和Lck的活性, 干扰了早期活化事件有关。另外, 也可能是由于对CD69等早期活化抗原表达的抑制而干扰了随后的活化事件, 从而抑制了T细胞的增殖反应。本研究是体外试验, 与Fang等的体内试验用药方法(胃饲给药)不同, 药物浓度比Verbeek等所用的浓度相比较高, 所以有明显的抑制效应。Morin具有抗菌、 抗肿瘤作用。Morin对金黄色葡萄球菌、 杆菌和黄色微球菌等都有抗菌作用10,   其抗菌机制主要表现为干扰细菌的DNA的合成11、 抑制细菌代谢相关的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和复制型DNA解旋酶RepA的双链DNA解旋活性12等。Hsiang等1研究发现, morin的抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 与本研究中morin对T细胞周期影响的