硝苯地平和机械力对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达影响

1、硝苯地平和机械力对人牙周膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的表达影响        【摘要】     目的 研究机械静态拉伸作用下，硝苯地平对人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）基质金属蛋白酶（MMP）-10和MMP-13的表达影响。方法 按弹力形变不同将细胞随机分为4组，分别为0%、8%、12%、16%形变组，每组再按照硝苯地平浓度不同分为4个亚组，分别为0、10、30、50 m亚组。硝苯地平孵育1 h后，给予细胞12 h静态拉伸，免疫组化染色检测细胞胞浆中MMP-10和MM

2、P-13的表达。结果 弹性形变为0%时，各亚组中MMP-10和MMP-13的表达无明显变化，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。当硝苯地平浓度为0 m时，8%、12%、16%形变组胞浆内MMP-10和MMP-13均呈高表达，且随形变的增大，表达呈上升趋势（P<0.001）；当加入硝苯地平后，随硝苯地平浓度的增加，MMP-10和MMP-13表达均呈下降趋势（P<0.001）。结论 硝苯地平对机械力诱导的MMP-10和MMP-13表达有抑制作用，提示钙离子通道参与机械力对HPDLF中MMP-10和MMP-13的诱导表达。     

3、【关键词】  人牙周膜成纤维细胞； 硝苯地平； 基质金属蛋白酶； 机械力     The effect of Nifedipine and mechanical strain on matrix metalloproteinase expression in human periodontal ligament fibroblast     NI Hui, ZHANG Miao-miao, DAI Jia-yin, SUN Miao.    （Dept. of Or

4、thodontics，School of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China）     Abstract  Objective  To investigate the effect of Nifedipine on matrix metalloproteinase（MMP）-10 and MMP-13 expression in human periodontal ligament f

5、ibroblast（HPDLF） induced by mechanical strain in vitro. Methods  HPDLFwas divided into four groups at random by mechanical strain of elongation 0%, 8%, 12% and 16%. Each group was divided into four subgroups again by the concentration of Nifedipine 0, 10, 30, 50 m. The cells were imposed to sta

6、te mechanical strain 12 h after incubated with Nifedipine 1 h. And then immunohistochemical staining was used to investigate the expressions of MMP-10 and MMP-13 in intracytoplasm. Results  In 0% group, there was no significant difference of MMP-10 and MMP-13 expression in all subgroups（P>0.

7、05）. The expressions of MMP-10 and MMP-13 were high in group 8%, 12% and 16% without Nifedipine, and increasing significantly with elongation（P<0.001）.The expressions of MMP-10 and MMP-13 decreased with dose increasing（P<0.001） in HPDLF after imposed to Nifide-pine. Conclusion  The expres

8、sions of MMP-10 and MMP-13 induced by mechanical strain were inhibited by Nifedi-pine, which suggested calcium ions channels participate in expressions of MMP-10 and MMP-13 induced by loading.    Key words  human periodontal ligament fibroblast； Nifedipine； matrix metalloproteina

9、se； mechanical strain    基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是参与牙周膜组织细胞外基质代谢的主要酶系统，通过降解细胞外基质发挥作用，与正畸力所致的牙周改建密不可分1。受细胞因子、生长因子、激素和机械应力2等因素的调节。MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-13都参与了牙周膜组织细胞外基质的降解3-4，认为机械力是通过直接作用于MMPs基因使人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，HPDLF）内MMPs表达增强5。然

10、而在机械力作用下，HPDLF出现最快的变化不是MMPs的表达升高，而是细胞内钙离子浓度的升高6。在正畸力诱导下，大鼠牙周膜成纤维细胞内MMP-10和MMP-13均呈高表达，而在给予钙离子通道阻滞剂硝苯地平后，二者表达均被抑制7。本研究在弹性培养皿内培养HPDLF，在给予一定浓度的硝苯地平后对贴壁细胞施加机械力，采用免疫组织化学法检测MMP-10和MMP-13的表达。    1  材料和方法    1.1  主要试剂        DMEM培养基、胎牛血清（

11、Gibco公司，美国），硝苯地平（Sigma公司，美国），兔抗鼠MMP-10多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗鼠MMP-13多克隆抗体（LAB VISION公司，美国）。    1.2  人牙周膜成纤维细胞的培养和鉴定        原代细胞培养采用酶消化组织块法8。取1216岁因正畸拔除的正常前磨牙牙根中1/3的牙周膜组织，直接胶原酶消化1520 min，移至培养皿内，使用盖玻片将组织盖住，CO2孵育箱中静置24 h后换液，待细胞长至皿底80%时传代。取第3代细胞进行鉴定，抗波形丝

12、蛋白呈阳性，抗角蛋白阴性，表明细胞为牙周膜成纤维细胞。取第5代细胞用于实验。    1.3  实验分组        按弹力形变不同将细胞随机分为4组，分别为0%、8%、12%和16%形变组，每组再按照硝苯地平浓度不同分为4个亚组，分别为0、10、30、50 m亚组。弹力形变为0%、硝苯地平浓度为0 m时，为正常HPDLF，设为对照组。    1.4  加力装置        根据Ngan等9的原

13、理，改良韩文利等10的方法，与哈尔滨工业大学共同研发细胞加力装置。其由3部分组成，分别为加力底座、球冠模具和弹力培养皿（图1）。加力底座与球冠模具相连，通过调节加力底座的旋钮，改变球冠模具高低，控制球冠模具与弹力培养皿底部的接触面积，拉伸弹力膜，力量通过弹力膜传递给贴壁细胞，达到加力的目的。    图 1  细胞加力装置图(略)    Fig 1  A schematic representation of device    1.5  细胞加力及细胞涂片的制作 &

14、#160;      将细胞传至0.01%型胶原处理过的弹力培养皿内，待细胞铺满皿底后进行实验。硝苯地平孵育细胞1 h，持续静态拉伸12 h后，制成细胞悬液，使其细胞密度为每毫升含有1×105个细胞，以每张玻片0.1 mL涂片，4%多聚甲醛固定，-20 保存。    1.6  免疫组织化学染色        对细胞采取常规PV法染色。3%过氧化氢孵育10 min，0.4%Triton-100穿透30 min，滴加一抗，-4 过夜，滴加二抗，室温孵

15、育30 min，DAB显色25 min。每步后均用PBS轻轻冲洗3×5 min。苏木素复染，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。选取正常乳腺癌细胞作为免疫组化阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。    1.7  统计学分析        细胞胞浆内MMP-10和MMP-13的表达量均用平均光密度值（average optical，AO）表示。采用SAS 9.1统计软件对实验数据进行析因分析。    2  结果  &#

16、160; 2.1  对照组HPDLF中MMP-10和MMP-13的表达        对照组细胞胞浆内MMP-10和MMP-13均为少量的棕黄色颗粒染色，呈少量表达。    2.2  各形变组HPDLF中MMP-10和MMP-13的表达        各形变组HPDLF中MMP-10和MMP-13的表达结果见图25。    A：对照组；B：0 m亚组；C：10 m亚组；D：30 m亚组；E：50

17、m亚组    图 2  各形变组HPDLF中MMP-10的表达(略)    Fig 2  Expressions of MMP-10 in the all groups    A：对照组；B：0 m亚组；C：10 m亚组；D：30 m亚组；E：50 m亚组    图 3  各形变组HPDLF中MMP-13的表达(略)    Fig 3  Expressions of MMP-13 in the all gr

18、oups        弹力形变为0%时，各亚组间MMP-10和MMP-13的表达无明显变化，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），均呈少量表达。当硝苯地平浓度为0 m时，8%、12%、16%形变组中胞浆内均可见大量的MMP-10和MMP-13棕黄色颗粒，与对照组相比表达均升高（P<0.001），而且随形变的增大，表达呈上升趋势（P<0.001）。当加入硝苯地平后，随着硝苯地平浓度的增加，8%、12%、16%形变组胞浆内棕黄色颗粒逐渐减少（P<0.001），MMP-10和MMP-13表达均呈下降趋势（P

19、<0.001）。    3  讨论        硝苯地平是二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，其阻滞钙离子内流的作用是通过与开放状态钙通道结合后促使通道向失活状态转化，如果钙阻滞剂与失活状态钙通道或静息状态通道结合，则阻止这种状态向激活开放状态转化；同时，钙阻滞剂主要是通过降低通道的开放概率来减少细胞的总钙内流量，药物本身并不影响钙通道数目以及单一通道的钙内流11。口腔医学中关于硝苯地平的研究主要集中在牙龈增生，认为硝苯地平等二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂可引起牙龈增生12-13。随着钙离子在信号传

20、导中的作用逐渐被人们认识，硝苯地平被应用于钙离子通道的研究中。Arora等14发现牵张力作用下，HPDLF内钙离子浓度的升高部分是由于L型钙离子通道开放引起的。故本实验选用L型钙离子通道阻滞剂硝苯地平作为实验干扰因素。        体外培养的HPDLF在持续张力作用后，可诱导MMP-1、MMP-2、金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1、TIMP-2 mRNA的表达，说明机械力可以调节HPDLF中MMPs和TIMP的表达，实现机械-生物信号传导2。MMPs主要

21、功能是降解细胞外基质中的胶原、纤维连接蛋白、层连接蛋白及黏蛋白等物质。其中MMP-10作用底物主要是无胶原基质和少量的胶原；而MMP-13主要以降解、型胶原为主。选取这2个指标，旨在全面分析机械力作用下硝苯地平对人牙周膜基质中所有成分的降解影响。        弹力形变为0%时，各亚组细胞MMP-10和MMP-13的表达量变化差异均无统计学意义，说明硝苯地平对无机械刺激的HPDLF中MMP-10和MMP-13的表达没有影响。硝苯地平浓度为0 m时，8%、12%、16%形变组MMP-10表达量均增加，且随形变增大而增加，证实体外静态拉伸

22、可诱导HPDLF中MMP-10表达升高。同样的条件下，MMP-13的表达也增加，且随着形变的增大而增多，这与Yang等15的研究结果类似。推测HPDLF感知机械力，并将机械力学信号转变为化学信号，导致一系列的生化反应，引起MMPs高表达的机制，可能与HPDLF胞膜上的钙离子通道有关。机械力引起钙离子通道开放，外钙内流，在钙离子信号作用下，-连环蛋白和钙黏蛋白向施加外力的细胞连接处募集，使细胞黏着小带的结构重组，此时全细胞内肌动蛋白聚合增加，使用免疫印迹密度测量法测得全细胞内的肌动蛋白聚合提高75%16，此现象可能是细胞感知机械刺激的起始，随着细胞骨架的重组，机械外力由细胞骨架传至胞内，通过力-

23、化学信号的偶合，导致DNA合成变化，细胞的生物学行为发生改变，最终引起蛋白酶合成分泌改变，使MMPs表达增高。        MMP-10和MMP-13在各形变下的表达趋势均一致，均是随着药物浓度的升高表达减少，说明机械力诱导MMP-10和MMP-13的表达与硝苯地平阻断钙离子通道有着密切联系；随着形变的增大，这种阻断效果越明显，可能与钙离子通道激活的数目有关，因为钙阻滞剂主要是通过降低通道的开放概率来减少细胞的总钙内流量，药物本身并不影响钙通道数目。尽管如此，当硝苯地平浓度为50 m时，细胞内仍有MMP-10和MMP-13表达，与正

24、常HPDLF中的表达量一致，说明机械牵拉诱导MMPs表达过程中的机械-生物信号转导，并不是单一的信息分子与单一受体的简单作用，而是多种因素通过细胞膜表面的多种通道综合作用的结果，其中钙离子通道的激活在这些信号事件中起重要作用。        本研究证实，机械牵张可使HPDLF中MMP-10和MMP-13的表达增加，而这种高表达可以被硝苯地平抑制，并与药物浓度有关。推测此现象与机械力激活钙离子通道，引起的细胞外钙离子内流，胞内钙离子浓度升高密切相关。    【参考文献】  1 Ryan

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