霍奇金淋巴瘤实验设计ppt课件

1、霍奇金淋巴瘤中IB基因突变的研讨 研讨背景霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，是恶性淋巴瘤的一个独特是恶性淋巴瘤的一个独特类型。类型。 研讨背景 其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开场，逐渐由临近的淋巴结向远处分散。原发于结外淋巴组织的少见。研讨背景 瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改动为大量反响性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞R-S细胞。 这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞)研讨背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均缺乏，HL的发病机制 尚未明确研讨背景

2、有研讨发现NF-B (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。1 IB作为重要的NF-B通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。研讨背景 将对IB激酶 IB kinase, IKK无反响的IB突变体导入HRS细胞中可阻断NF-B的活化，导致细胞凋亡，阐明IB在HL发病机制中有重要作用。2研讨背景 Emmerich等人的研讨阐明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白程度检测的阳性强度弱，能够与HL中泛素化降解活性加强有关，也能够由IB蛋白构造改动导致。3研讨目的 本实验意在： 了解IB基因在HL中突变的情况； 分析经典型HL HRS中IB突变的特点、能够呵斥的蛋白构造异常；

3、 以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。实验资料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20 Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物北京赛百胜公司 PCR仪包括反响体系 DNA测序仪实验流程CD30免疫组化激光显微切割和DNA 提取IB基因扩增PCR产物检测待测基因外含子测序CD30免疫组化 采用EnVision两步法。 将冰冻组织切成6m厚延续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然枯燥；CD30免疫组化 6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；

4、加1：20稀释的一抗； 加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。激光显微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8。 将目的细胞从切片上分别，在光压强作用下被搜集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。 切割周围的正常淋巴细胞每例2管， 每管约50个细胞。 扩增目的基因，上游引物： 5-CACACTGTGCCCATCTACG-3，下游引物：5一GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC一3。 缓冲体系：10X反响缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l

5、，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l， 模板20 l，总体积25 l。反响条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4终了。 以双蒸水替代DNA模板作为阴性对照。IB基因扩增 对HRS细胞、背景中反响性增生细胞的IB 6个外显子进展半巢式PCR扩增。 用知IB外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。PCR扩增反响体系扩增扩增IB第一和第二外显子反响体系：第一和第二外显子反响体系：

6、 10 X PCR缓冲液缓冲液50 1，MgC1：(25mmoiL)50 Ixl，dNTPs(10 mmol L)20 l，DMSO20 l，Taq DNA聚合酶聚合酶(5 UpJ)10 l，DNA模板模板(05 gIL1)20 l，扩增第一外显子时加引物，扩增第一外显子时加引物1 Ixl；扩增第；扩增第二外显子时加引物二外显子时加引物03 l，补所需，补所需ddH2O使反响体系到达使反响体系到达50 I。反响条件：。反响条件：预变性预变性95 ，5min，继而，继而95变性变性50 s，65退火退火30 s，72延伸延伸90 S，共共35个循环，最后个循环，最后72延伸延伸10 min。第二

7、轮，反响体系。第二轮，反响体系50 l，扩增第一和，扩增第一和第二外显子时加引物第二外显子时加引物125 l。扩增第一外显子时另加。扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第扩增第二外显子时不加二外显子时不加DMSO)。反响条件同第一轮。反响条件同第一轮。扩增扩增IB第三到第六外显子反响体系：第三到第六外显子反响体系： 第一轮，第一轮，l0PCR缓冲液缓冲液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶聚合酶(5 U L)10 l，DNA模模板板(05 g L)20 l，引物，引物1 l。反响条件同扩增一、二外显子者，。反响

8、条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为但退火温度为63。第二轮，反响体系同第一轮，但扩增引物为。第二轮，反响体系同第一轮，但扩增引物为125 L。反响条件为预变性反响条件为预变性95 ，5 min，继而，继而95变性变性50 S，65退火退火30 S，72 oC延伸延伸90 S，共，共35个循环，最后个循环，最后72延伸延伸10 min。PCR产物检测 取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。 紫外灯下察看。 IB的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、

9、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。预期结果电泳电泳条带不在同一程度线上基因明显突变。预期结果电泳电泳条带在同一程度线上。没有突变点突变或分子量很小的碱基序列突变待测基因外含子测序 每管DNA样品都要扩增2次，运用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进展直接测序。预期结果测序碱基序列出现改动图A-箭头处为T-A突变TGA为终止密码图B-反向测序证明蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G预期结果碱基序列没有突变 C、D分别为没有突变的正、反向测序预期结果 肿瘤细胞IB基因突变率高，而反响性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。 肿瘤细胞和反响性增生的淋巴细胞的IB基

10、因都没有突变。 肿瘤细胞和反响性增生的淋巴细胞的IB的突变率都添加IB基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化估计不会发生这种情况，如假设发生那么需求进一步研讨参考文献1 Bargou R.C, et al. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J. J Clin Invest, 2019, 100 (12): 2961-9.2 Dejardin

11、 E, et al. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J. Oncogene, 2019, 18(16):2567-77.3 Emmerich F, et al. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J. Blood,

12、 2019, 94(9): 3129-34. Thank you！巢式PCR 巢式聚合酶链反响巢式聚合酶链反响(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式也称套式PCR。 在这种技术中，首先用一对外引物进展第在这种技术中，首先用一对外引物进展第1轮轮PCR，然后再运用第，然后再运用第1对引物扩增的对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式巢式PCR。为了经济节约，可在第。为了经济节约，可在第2轮扩增轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第物与第1轮扩增共用，。轮扩增共用，。 反向测序 一个是正向引物上游引物，用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3 另外一个就是反向引物下游引物，用它来测序就是反向测序从下游往上测序，也就是3到5 假设片段在800以内，那么随意进展一个方向就能测出他