尼莫地平对AD大鼠脑组织NO的影响

1、尼莫地平对AD大鼠脑组织NO的影响    摘要 目的 探讨尼莫地平改善痴呆大鼠模型学习记忆能力的机制。方法 随机将30只大鼠分为三组,空白对照组不作处理,模型组和尼莫地平组用A2535脑海马注射造模,尼莫地平组给予尼莫地平干预。2周后进行迷宫实验,比较各组大鼠行为上的差异。3周后脑组织NO检测,进行组间比较。结果 尼莫地平组学习记忆能力优于模型组,三组脑组织NO含量,经方差分析有显著性差异(P<0.01)。结论 尼莫地平能改善痴呆大鼠模型的学习和记忆能力,这种改善可能与维持Ca2+稳态、保护脑组织、减少NO等神经毒损害有关。 关键词 阿尔茨海默病;

2、 尼莫地平; 一氧化氮 中图分类号 R749.16 文献标识码 A 文章编号 1673-9701(2010)07-05-03 Effect of Nimodipine on AD Rat Brain Tissue NO GAO Lu1 WANG Chaowei1 HU Weimin2 1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Neurology,the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Ch

3、ina Abstract ObjectiveTo explore the mechanism of whether nimodipine can improve learning and memory in dementia rat model. Methods Thirty rats were randomly divided into three groups:control group with no treatment,the model group and nimodipine group. The dementia rat model was established by inje

4、ction of brain hippocampus A2535,and the nimodipine group was given nimodipine intervention. The maze test was carried out after two weeks and the comparison was made of the differences in rat behavior of the three groups. The brain tissue NO content was detected after three weeks and the comparison

5、 was made in the three groups. ResultsBoth learning and memory of the nimodipine group were better than those of the model group. The NO content in the brain tissue of the three groups was detected,and the analysis of variance showed a significant difference(P<0.01). ConclusionNimodipine can impr

6、ove learning and memory of dementia rat,which may be related to the maintenance of Ca2+ homeostasis and protection of brain tissue,such as reduction of NO neurotoxicity damage. Key wordsAlzheimer disease; Nimodipine; NO 1994年Khachaturian提出了阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的钙稳态学说1,认为细胞Ca2+ 浓度的持续升高会导致神经细胞损

7、伤和凋亡。细胞培养和动物实验证明,Ca2+稳态失衡与AD病理特点有关2。高Ca2+可活化氧化氮合酶,产生NO。NO是一种自由基,在中枢神经系统参与多种病理和生理作用。实验证明,海马内NO的表达和学习记忆密切相关。血管性痴呆时脑脊液中NO浓度与痴呆程度呈正相关。尼莫地平(NIM)是二氢吡啶类钙拮抗剂,动物实验证明,它能增加动物的探究行为、改善学习记忆功能。本实验用NIM干预过的AD大鼠模型进行行为学和NO含量的对照研究,以证明钙稳态学说和NIM的治疗作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 健康Wistar雄性大鼠30只,月龄5,由山西医科大学实验动物中心提供,体重200250g。

8、 1.1.2 药物 尼莫地平片由天津市中央药业有限公司生产,批准文号:国药准字H20043915。 1.1.3 试剂 A2535溶液,由Sigma公司生产;NO试剂盒由南京建成科技有限公司生产。 1.1.4 主要仪器 大鼠脑立体定位仪、颅骨钻,由淮北正华生物仪器有限公司生产;Morris迷宫,由中国医学科学院药物研究所生产。 1.2 方法 1.2.1 分组及给药方法 实验大鼠随机分为空白对照组、模型组与尼莫地平组,每组10只,模型组和尼莫地平组制作成AD模型,尼莫地平组给予NIM 10mg/(kg·d)灌胃,连用3周。 1.2.2 造模方法 模型组与尼莫地平组大鼠腹腔注射10%水合氯

9、醛麻醉,参考大鼠脑立体定位图谱,将大鼠的头固定在立体定位仪上,剪去局部毛发,消毒后沿矢状线切开皮肤约1.5cm,暴露颅骨,确定海马区注射点(前囟后3mm,中线旁开2mm),用颅骨钻在颅骨上打孔,用微量注射器沿穿刺孔垂直进针3.5mm,缓慢注射A2535溶液5g,5min内注射完,留针5min,拔针后牙科泥封住穿刺孔,术区滴庆大霉素,缝合皮肤并消毒。肌肉注射青霉素10万U/d,连续3d,防止感染。 1.2.3 Morris迷宫 造模前1周大鼠进行Morris迷宫训练,取第6天游迷宫所需时间与造模后第1次游迷宫时间进行对照,数据见表1。造模2周后,再进行迷宫实验,逐一记录每只大鼠从3个远象限入水到

10、找到平台所需的时间,合计后取各组均值,连续记录6d,数据见表1。 1.2.4 检测指标及过程 造模3周后,断头取脑。用组织匀浆器充分研磨,生理盐水稀释,2500r/min,离心5min,取上清液,置-20冰箱中备检。按NO测定试剂配置要求,用分光光度计检测和计算NO含量。数据见表2。 1.2.5 统计学处理 采用SPSS13.0进行统计学分析,实验数据用均数±标准差表示。经检验,该资料满足方差分析的条件,因此,采用方差分析进行分析。 2 结果 2.1 造模前、后游迷宫所需时间 造模前游迷宫所需时间为(25.19±9.35)s,造模后游迷宫所需时间(159.22±1

11、6.24)s。实验结果显示,造模前后游迷宫所需时间有明显差异(t=2.967,P<0.01),差异有统计学意义,证明造模成功。 2.2 三组游迷宫所需时间 见表1。实验结果显示,模型组学习记忆力下降,表现为游至安全平台时间最长,与空白对照组及尼莫地平组比较差异有显著性,而且随着训练次数增加,差异更加明显。第6天F=86.78(P<0.05),实验证明NIM对记忆功能有增强作用。 2.3 各组NO指标分析 见表2。NO指标三组经方差分析,F=79.302,差异有统计学意义(P<0.01)。进一步采用LSD-t的方法进行两两比较,空白对照组与模型组比较t=3.963,尼莫地平组与

12、模型组比较t=2.831,尼莫地平组与空白对照组比较t=2.922,结果差异均有统计学意义(P<0.01)。 3 讨论 Ca2+是重要的细胞内信使之一,对神经发展、突触传递和可塑性及各种代谢途径调控也至关重要3。进入老年,神经细胞Ca2+调节系统功能出现紊乱,细胞内Ca2+浓度升高、Ca2+内流增加、线粒体缓冲Ca2+的能力下降等4。Ca2+失衡的原因除与年龄有关外,与基因突变、A、谷氨酸、NO等错综联系。对早老基因(PS)研究,PS促成内质网Ca2+通道形成和增加通道的渗透性,还影响1,4,5三磷酸肌醇受体(IP3R)5,实验证明Ca2+进入细胞质主要是通过IP3R途径实现的。IP3R

13、是存在于内质网、肌浆网及核膜上的一种配体门控Ca2+通道蛋白,精确地调控胞浆内Ca2+浓度的变化。风险基因研究发现,增加CALHM1蛋白在细胞膜和内质网质膜表达,也可增加Ca2+进入细胞和提高细胞内Ca2+浓度6。高Ca2+能调节-淀粉样蛋白前体(APP)的加工,增加A的生成和毒性作用;另一方面,A能嵌入细胞膜,形成A通道,通过调节细胞膜离子通道,破坏细胞离子稳态,加剧Ca2+失衡,导致氧化应激、线粒体损伤、突触功能障碍,高Ca2+还可促进Tua蛋白过度磷酸化。中枢神经系统中谷氨酸水平过高可导致NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体的过度激活,从而细胞内敏感的细胞器,如线粒体、内质网内Ca2+

14、积聚,阻止Ca2+从内质网流到线粒体或者缓冲细胞内Ca2+,可减少凋亡刺激的敏感性。所以说Ca2+失衡是脑老化和AD的关键。NO有扩张血管、抑制血小板聚集与黏附、炎症介质等作用,还是重要的信号传递物质。过高的NO被认为可促使炎症细胞功能紊乱和神经系统疾病,在神经退行性疾病时生成增多被看作氧化应激的后果7。Ca2+内流增加,活化氧化氮合酶,产生过多的NO。NO再分解成亚硝酸盐(ONOO-),这是一种高活性的氧自由基物质,可引起DNA氧化损伤,还可与某些含亚铁原卟啉基因的铁原子结合,形成亚硝酸铁络合物,从而抑制线粒体呼吸作用8。  综上所述,减少Ca2+内流可以减少NO的过多生成及降低其

15、他病理过程的风险,起到脑保护作用。一些AD患者应用左旋电压门控制Ca2+通道(L-VGCCS)阻滞剂,提高了学习和记忆能力,这说明AD神经变性与钙通道有关9。本实验思路就是使用NIM减少Ca2+内流,探讨Ca2+与NO的关系。NIM易透过血脑屏障,海马、皮质、丘脑等结构,含有高密度的二氢吡啶结合部位,所以NIM可能对AD的治疗作用更优于其他类钙拮抗剂。实验中尼莫地平组在Morris迷宫中找到平台的时间优于模型组,而且随着训练次数的增加,这种优势更加明显。NO含量测定,尼莫地平组数值介于空白对照组和模型组之间,一方面说明NIM通过维持Ca2+稳态,减少了NO的生成,有利于AD的恢复;另一方面脑N

16、O测定结果与迷宫实验结果平行,说明脑NO含量变化与AD大鼠学习记忆能力有关。空白对照组含量最低,说明NO含量只有在一定水平时才能发挥生理作用;模型组含量最高,说明过高的NO含量具有神经毒作用,不利于AD的恢复。 参考文献 1 Lukasz Bojarski,Jochen Herms,Jacek Kuznicki. Calcium dysregulation in Alzheimers diseaseJ. Neurochemistry International,2008,52:621-633. 2 Behnam Sabayana,Mohammad Reza Namazi,Arash Mowla

17、,et al. Are patients with Darier and Haily-Haily diseases susceptible to Alzheimers Disease?a Theory based on abnormal intraneuronal Ca2+ homeostasisJ. Journal of Alzheimers Disease,2009,16:521-523. 3 Antonio Pisani,Paola Bonsi,Paolo Calabresi. Calcium signaling and neuronal vulnerability to ischemi

18、a in the striatumJ. Cell Calcium,2004,36(3-4):277-284. 4 Ilya Bezprozvanny,Mark PM. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimers diseaseJ. Trends Neurosci,2008,31(9):454- 463. 5 David HS,Robert Gasperini,Adele JV,et al. The role of A-induced calcium dysregulation in the pathogenesis of Alzheimers diseaseJ. Journal of Alzheimers Disease,2009,16(2):225-233. 6 Rudolph ET,Lars Bertram. Alzheimer's disease:the latest