利用激光共聚焦图像系统检测实验性变态反应性脑脊髓炎动物淋巴细

1、    利用激光共聚焦图像系统检测实验性变态反应性 脑脊髓炎动物淋巴细胞内游离钙浓度        摘要: 目的进一步探讨多发性硬化（MS）和实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的发病机制。方法取EAE动物的脾细胞，制备淋巴细胞悬液，以荧光探针Fluo-3/AM负载后，通过激光扫描共聚焦显微镜（Insight plus IQ, Meridian, USA）检测细胞荧光强度，其荧光强度与细胞内钙离子浓度成正比。结果EAE组淋巴细胞内钙离子浓度明显高于正常对照组。结论细胞

2、内钙在EAE动物淋巴细胞的过度活化方面发挥重要作用。关键词： 共聚焦显微镜检查； 实验性变态反应性脑脊髓炎； 钙； Fluo-3/AM中分类号： R392.1文献标识码： A文章编号： 1006-2963 （2000）03-172-03Measurement of Lymphocyte Ca2+i in Guinea Pigwith EAE by Confocal MicroscopeZHANG Feng-yun, LU Xue-ying, ZHANG Biao, WANG Li-qun, ZHOU Gui-sheng, ZHAO Yu-ying, LI Dian-jun(Department

3、 of Immunology , Haerbin Medical University , Haerbin 150086 , China)ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the implicated pathogenesis of multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. MethodsThe Lymphocytes from guinea pig with experimental allergic encephalomyelitis (EAE) were loaded

4、with Flou-3/AM, a Ca2+ fluorescent indicator.The intracellular calcium concentration (Ca2+i ) was measured by using confocal microscope and Ca2+i changes were represented by fluorescent intensities. ResultsThe Ca2+i was significantly increased in lymphocytes of guinea pig with EAE compared with that

5、 of normal control group. ConclusionThe Ca2+i played an important role in lymphocyte activation of EAE.Key words : confocal microscope ; experimental allergic encephalomylitis; calcium; Fluo-3/AM实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis,EAE）是人类多发性硬化（MS）的动物模型，主要表现为以脱髓鞘为主的迟发型超敏反应，是一种自身免疫性疾病

6、，其CD4+细胞（主要是Th1细胞）过度活化，而Ca2+是参与细胞活化的重要成分1。为进一步探讨在EAE动物淋巴细胞活化中Ca2+的浓度变化，我们以Fluo-3/AM荧光染料负载细胞，用激光扫描共聚焦像系统检测了EAE动物淋巴细胞内游离钙浓度(Ca2+i )。1材料和方法1.1EAE模型的建立2月龄雌性豚鼠14只（购自中国农业科学院哈尔滨市兽医研究所），体重300 g左右。随机分组，其中实验组7只，正常对照组7只。实验组以自提牛脑加佐剂免疫2，于免疫后第15 d处死豚鼠。正常对照组豚鼠注射等量生理盐水加佐剂，于注射后15 d处死。1.2淋巴细胞的分离处死鼠后立即无菌取脾，制备脾细胞悬液，Han

7、k液洗涤3次后以无酚红无血清RPMI-1640调细胞浓度为1×109/L，取1 mL置eppendorf管中。1.3荧光探针Fluo-3/AM负载3将4 mol/L Fluo-3/AM加至细胞悬液中，置37 40 min。以PBS洗3次后，再悬于1 mL PBS中，滴1滴于载玻片上，加盖玻片备用。1.4Ca2+i 检测3样品置于激光扫描共聚焦显微镜（Insight plus IQ,Meridian, USA）上，目镜为40倍。以荧光强度代表Ca2+i ，实验数据直接输入计算机进行处理和像分析。1.5统计学分析结果以±s表示，两组间均数比较采用t检验。2结果附表EAE动物淋巴

8、细胞内钙离子浓度TableIntracellular Ca2+ concentration of lymphocyte in guinea pig with EAE(±s)GroupnFluorescent intensityEAE72711.29±341.00*Normal71194.50±206.72*P0.01 compared with normal group EAE动物淋巴细胞内游离Ca2+浓度的测定结果如附表所示，Ca2+i 以荧光强度表示。由附表可见，EAE组动物淋巴细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常对照组（P0.01）。附中a，b分别显示EAE动

9、物单个淋巴细胞内Ca2+浓度 (a) 及正常对照组单个淋巴细胞内Ca2+浓度 (b)。中右侧标尺为不同颜色所代表的荧光强度。附(a)免疫后第15d EAE动物单个淋巴细胞内Ca2+(b)正常对照组动物单个淋巴细胞内Ca2+浓度Fig(a)IntracellularCa2+i of a single lymphocyte in EAE animal at 15th day after immunization(b)IntracellularCa2+i of a single lymphocyte in normal animal3讨论细胞内Ca2+主要分布在内质网、线粒体和高尔基体等细胞内的钙库

10、中，在外界信号刺激下，通过细胞内的信息传递使细胞内的Ca2+释放入细胞质中，从而诱导一系列反应4。资料表明，髓鞘碱性蛋白（MBP）刺激T细胞活化，造成迟发型超敏反应。抗原（MBP）与T细胞抗原受体（TCR）结合后产生的信号传入T细胞内，使磷脂酶C活化，催化磷脂酰肌醇4?5二磷酸水解产生二乙酰甘油（DAG）和1?4?5三磷酸肌醇（IP3），IP3可使Ca2+i增高。DAG和增高的Ca2+ 作为T细胞活化的第一信号促使蛋白激酶C（PKC）和其他钙依赖性蛋白酶活化，催化细胞内多种蛋白质的丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸残基发生磷酸化，进而在IL-1和其他协同刺激因子的作用下启动T细胞活化，由于T细胞的过度活化

11、造成EAE发病。Romagnani5指出，Th1细胞及Th1型细胞因子（IL-2、IFN-、TNF等）参与了MS及胰岛素依赖性糖尿病等某些器官特异性自身免疫病的发病。我们曾报道了EAE动物细胞产生的IL-2、TNF-的生物学活性及IFN-水平明显增高，证实了其Th1细胞过度活化6 。本研究进一步证实，Ca2+i在EAE动物的淋巴细胞过度活化过程中发挥重要作用，这对研究MS 的发病机制及治疗自身免疫病有一定的意义。(本文附见插页第页)基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目（D-9522）作者简介：张凤蕴（1943-）,女,山东省龙口市人，教授，主要从事神经免疫和移植免疫研究。通讯地址：哈尔滨医科

12、大学免疫教研室，哈尔滨 150086。联系电话：(0451)6674566。张凤蕴（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）吕雪莹（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）张飚（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）王丽群（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）周贵生（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）赵育莹（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）李殿俊（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150086）参考文献：1Kasai H,Augustine GJ. Cytosolic Ca2+ gradient triggering unid

13、irectional fluid secretion from exocrine pancreas J. Nature, 1990,348：735-738.2王琳，张凤蕴，王丽群. MBP的提取、鉴定及EAE模型的建立J. 哈尔滨医科大学学报，1998，32（1）：12-14.3Li BY, Qiao GF, Zhou H,et al. Effects of berbamine on ATP-induced Ca2+i mobilization in cultured vascular smooth muscle cell and cardiomyocyteJ. Acta Pharmacol Sinica, 1999,20(8)：705-708.4Berridge MJ. Inositol trisphophate and calcium sigalli