土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、1 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 、理论基础 1筛选菌株 (1) 实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 _ 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 _ 或 其他微生物生长。 (2) 选择培养基：在微生物学中，将允许 _ 种类的微生物生长，同时 _ 和 _ 其他种类微生物 生长的培养基，称作选择培养基。 (3) 配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素， 可以选择培养 _ ；的微生物加入高浓度的食盐可选择培养金黄 色葡萄球菌等。 2 统计菌落数目 (1) _ 测定微

2、生物数量的常用方法有 和 。 (2) 稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的 _ 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 _ 。通过统 计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 _ 的平板进 行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 _ 直接计数。 3设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中 _ 对实验结果的影响，提高实验结果的 _ 。例如为 了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养 _ 的培养基作为空白对照。 二、实验设计 关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下： 1 _ 取样：从肥沃、湿润的土壤中取

3、样。应先 _ 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备 好的 _中。 2制备 _ :准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋 白胨培养基上生长的菌落数目应明显 _ 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作 为 _ ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。 3 微生物的 _ 与观察 将10g 土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 _ ，转移至盛 2 有 _ 的生理盐水的无菌大试管中， 将土样以1、101、102 依次等比稀释至107稀释度，并按照由107 103稀释度的顺序分别吸取 _ 进行平板涂布操作。每

4、个稀释度下需要 3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨 培养基。 将涂布好的培养皿放在 30C温度下培养，及时观察和记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 _ 培养基的斜面中，观察能否产生如教材中的颜色反应。 4. 细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在 _ 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 3个平板进行 重复计数，然后求出 _ ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。每克样品中的 菌株数= _ C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M: 稀释倍数。 三、鉴定 1、尿素CO(NH 2)2重要的农业氮肥。被土壤中细菌分解为 NH3才能被植物吸收利用

5、。 细菌歸酶 CO(NH;) )2 + HO - CO； +2NH 2、酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨 T培养基碱性增强 T酚红变红T结论：该细菌能分解尿素。 注意： 1、 在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间) ，同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。 2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 思维升华 1. 分离尿素分解菌操作中的注意事项 (1) 在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。 (2) 样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有 30300个菌落，细菌一般为 104、1

6、05、106倍的稀释液，放线菌一 般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为 102、103、104倍的稀释液。 为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。 (4) 每一稀释倍数的菌液都至少要涂布 3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊 的，需要对该平板重新制作。 注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌： 3037 C,培养12 d;放线菌：2528 C,培养57 d ; 霉菌(真菌):一般在2528 C,培养34 d。 (6) 微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的

7、特征。 (7) 做好标记 本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。 3 (8) 规划时间 对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。 2. 结果分析与评价4 内容 结果分析 育无杂菌污染的判斷 对照的培养nil中无茵落生长 a 未被杂酉污染 培养基中苗落叛倫高一被杂茵污染 菌落形态客样，菌落叛偏高一培养物中混入其他杂菌 选择培养基的帰迭作用 牛肉膏蛋白啄培养基的菌落藪目大于选择涪养基的數 S 一选择培养基具有筛选作用 样品的稀释操作 得到2个或2个以上曲落救目在30300的平板操作 成功 重复组的结果 若选取冋种土样，统计结果应接

8、近 、研究思路 1以下是分离土壤中分解尿素的细菌的培养基成分表，据表分析: 成分 KH：P0： aHP04 * TTtO 尿素 琼脂 水 含量 1.理 2*lg 0.陀 10, Og LOg 15. Og 适量 （1）表中的KH2PO4、NaHP04和MgS0 4 72O为细菌提供 ，葡萄糖为细菌提供 ，尿素为微生物 提供 。琼脂的作用是 _ _ 。 （2）如果将利用蛋白质和多肽为唯一氮源的微生物培养在该培养基上，能否长出相应的菌落? 数往往比活菌的实际数目低，原因是 _ （2）在三位同学的统计中，只有一位同学的统计是正确的，指出另两位同学的统计为什么不正确? _ 。 （3）除了上述方法外还可

9、以用显微镜直接测定微生物的数量，通过显微镜直接计数法得到的一定是活菌数吗? _ 。要得到活菌数应该采取的措施是 _ _。 3在做本课题实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约 只选择出大约50个菌落。 （1）你认为出现A同学这种结果的原因可能是什么？ _ 设计对照实验，帮助 A同学排除影响实验结果的因素。 _ （2）在探究实验中，实验设计要遵循 _ _ 等原则，即实验组和对照组只有 不同, 在该培养基上生长繁殖的微生物只能是 。这种培养基被称做 培养基。 。能够 2三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量。在对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下统计结 果: 甲同学涂

10、布了一个平板，统计的菌落数是 乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是 丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是 260 ； 210、240和250，取平均值 233 ； 21、212和256，取平均值163 ； （1） 一个菌落就是一个细菌吗? 。一个菌落可以代表样品中的一个活菌吗? 。事实上，统计的菌落 150个菌落，而其他同学在同样的稀释度下 _ 。针对你提出的可能原因, 5 其它条件都相同。这样可以排除任何其他可能原因的干扰，确保实验结果是 引起的，从而提高实验 结果的 。 二、实验设计 以下是土壤中某样品细菌的分离与计数实验流程: （1） 土壤取样前应对小铁铲和盛土的纸袋进行 处理,取土样时

11、要铲除表层土的原因是 _ L。 （2） 实验流程中， _ _ 等操作都要在火焰旁进行。 （3） 分离不同的微生物其稀释度相同吗？为什么？ _ 。但稀释的结果是相同的，即 _ _ 。测定土壤中分解尿素的细菌时，一般选用的稀释度是 。 （4） 涂布平板时，每个稀释度下需要涂布 个选择培养基和 个牛肉膏蛋白胨培养基，前者遵循了 _ 原则，后者起 作用。计数时对 培养基中的菌落数取其 。 （5） 某同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，他在三个培养基表面分别涂布稀释 106倍的O.ImL 菌液，经培养后得到的菌落数分别是 222、212和241。那么每克样品中的菌株数是 。 （6） 为进一步

12、确定得到的是能够分解尿素的细菌，可以在选择培养基中加入 ，如果 ，我 们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。6 【参考答案】 预习案： 一、 1 （1 ）目的菌珠 抑制 阻止（2）特定 抑制 阻止（3）自养 能固氮的微生物； 2（1）有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）.稀释度细菌 30-300显微镜 3非测试因素 可信度无杂菌污染 二、 1. 土壤，铲去表层土。 2.培 养基 多于对照 3培养 1ml 9ml 0.1mL 4.30-300 平均数 重难探究： 1、 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公 式进行计算 2、 这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株 /kg ）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌 氧细菌数约为2185万，放线菌数约为 477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件