不同肿瘤细胞诱导分化时表面N-糖链结构变化的比较研究

1、    不同肿瘤细胞诱导分化时表面N-糖链结构变化的比较研究        摘要：目的为比较不同肿瘤细胞株诱导分化时表面N-糖链结构的变化。方法采用ConA和DSA凝集素亲和柱层析法分析SMMC 7721人肝癌细胞受ATRA和db-cAMP以及HL-60人早幼粒白血病细胞受ATRA和PMA诱导分化时细胞表面糖蛋白上N-糖链的结构变化。结果ATRA和db-cAMP均使SMMC 7721细胞表面高甘露糖型/杂合型和三/四天线复杂型N-糖链减少而二天线复杂型N-糖链增多。ATRA和

2、PMA也均使HL-60细胞表面三/四天线N-糖链减少和二天线N-糖链增加，但却使高甘露糖型/杂合型N-糖链增加。结论同一细胞受不同诱导剂分化时，其表面N-糖链的结构有相同的变化，也有不同的变化；而使用同一化合物诱导不同细胞时也是如此。关键词：肿瘤细胞培养；诱导分化；膜蛋白N-糖链；凝集素中分类号：Q254；R730.2文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)02-0084-04A COMPARATIVE STUDY ON STRUCTURAL ALTERNATIONS OF N-GLYCANS ON SURFACE OF SMMC 7721 AND HL-60 CELL LINE

3、S INDUCED BY DIFFERENTIATING AGENTSZHAO Jia-hongLI ZhongDONG Sui-caiCHEN Hui-li?. （Key Laboratory of Glycoconjugate Research, Ministry of Health, Shanghai Medical University, Shanghai China 200032）Abstract：ObjectiveTo compare the changes in the structure of N-glycans on the cell surface during the i

4、nduced differentiation of different tumor cell lines. MethodsThe structural changes of surface N-glycans on human hepatocellular carcinoma cell line, SMMC 7721, induced by all-trans retinoic acid (ATRA) or dibutyryl-3', 5'-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP), as well as on acute promyel

5、ocytic leukemia cell, HL-60, induced by ATRA or phorbol-12 myristate-13-acetate (PMA) were analyzed by using ConA and DSA lectin affinity column chromatographies.ResultsIt was found that the content of high-mannose type/hybrid type N-glycans and tri-/tetra- antennary complex type N-glycans were decr

6、eased, while biantennary complex type N-glycan was increased on SMMC 7721 cell surface by ATRA or db-cAMP treatment. The content of tri-/tetra- antennary complex type N-glycans was decreased and the biantennary complex type N-glycan was increased on the surface of HL-60 cells by the treatment of ATR

7、A or PMA, but the content of high-mannose type/hybrid type N-glycan was increased by these treatments, the change was just opposite to that of SMMC 7721 cells. ConclusionThese results suggest that the structure of surface N-glycans shows not only the same changes, but also some different changes in

8、the induced differentiation of same cell line by different compounds or of different cell line by same compound.Key words：Tumor cell culture;Induced differentiation;N-glycan of membrane proteins;Lectins细胞恶变时通常伴有表面糖复合物组成和糖链结构的变化，而细胞分化时又常伴有相反的改变1。但是不同肿瘤细胞在诱导分化时表面糖链结构的变化是否相同，有无规律可循的问题一直悬而未决。本文利用全反式维甲酸(

9、ATRA)和双乙酰3，5环磷酸腺苷(db-cAMP)使SMMC 7721人肝癌细胞诱导分化2，3，并用ATRA和佛波醇-12-豆蔻酰-13-乙酸酯(PMA)使HL-60人急性早幼粒白血病细胞诱导分化4，5，比较两种衍生来源不同的肿瘤细胞在诱导分化时表面天冬酰胺连接型(N-)糖链结构的改变。材料和方法一、实验材料RPMI-1640培养基为GIBCO产品；3H-甘露糖(3H-Man,0.74×1012Bq/ml)购自上海原子核研究所；Sephadex G25为Pharmacia产品；各种凝集素、神经氨酸酶、db-cAMP、ATRA均为Sigma产品；链霉蛋白酶(Pronase E)、-甲

10、基甘露糖(-MM)为Merck产品，其他试剂为国产分析纯；细胞株由中科院上海细胞研究所提供。二、细胞培养及诱导分化剂处理培养基中ATRA和db-cMAP处理SMMC 7721细胞的终浓度分别为10 mol/L和0.5 mmol/L，ATRA和PMA处理HL-60细胞的终浓度分别为1 mol/L和0.1 mol/L。以上试剂的储存液均溶于乙醇中，对照细胞培养中只加相同浓度的乙醇，SMMC 7721细胞和HL-60细胞分别培养5 d和3 d。以上实验条件均经多次预实验确定，并已成为我室常规2，3，6。三、3H-Man标记的细胞表面糖链的制备按我室常规6细胞收集前12 h向培养基中加入3H-Man(

11、370 kBq/ml)以标记糖蛋白的N-糖链。细胞收集后用PBS洗涤2次，加2 ml含链霉蛋白酶缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0, 2.5 mmol/L CaCl2， 0.5 mmol/L MgCl2， 200 g/ml链霉蛋白酶)，室温放置5 min提取细胞表面糖蛋白，离心后测定上清液的蛋白浓度及放射比活性(cpm/g蛋白)。样品再在0.1 mol/L NaOH中置25 保温18 h以去除O-连接型糖链。冷却并中和后，再加入过量的链霉蛋白酶在37 消化72 h，并于24 h，48 h补充链霉蛋白酶。沸水浴5 min后离心去除蛋白酶，经Sephadex G-25柱层

12、析，用蒸馏水洗脱去除无机盐和其它低分子物质，获得的3H-糖肽一般只带13个氨基酸残基，故又可称作糖链或聚糖(glycan)，浓缩去盐后，收集放射性组分备用。四、凝集素和层析柱的制备按Ito法7将伴刀豆球蛋白(Con A)，或欧曼陀罗凝集素(DSA)和Sepharose 4B共价交联，交联率分别为98.4 %和87.8 %，装柱0.8 cm×5 cm，分别用缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl，含0.15 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl2和CaCl2，pH 7.5)和缓冲液B(10 mmol/L，Tris-HCl,pH7.4)平衡后备用。五、凝集素亲和

13、柱层析上述制备的3H-糖链上Con A柱(对照和分化剂处理样品其上样的cpm基本相等)，放置20 min后先用缓冲液A洗脱Con A不结合组分(Con A-)，再用含10 mmol/L及0.2 mol/L -MM的缓冲液A分别洗脱Con A弱结合(Con A+)和Con A强结合(Con A+)组分。另取一部分3H-糖链用神经氨酸酶(Clostridium perfringens)切除糖链末端的唾液酸7，以避免唾液酸的存在影响糖链和DSA的结合8。上DSA柱后也放置20 min，先用缓冲液B洗脱DSA不结合组分(DSA-)，再用含1%二聚及三聚(11)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)2-3的

14、缓冲液B洗脱DSA结合组分(DSA+)。各组分的收集管分别合并后，测cpm，按各组分cpm的总和为100 %，计算各组分的百分率。本法也为我室常用技术。Con A和DSA层析柱的回收率分别为97.5 %及101.4 %，实验方法的重复性试验批内CV为0.062，批间CV为0.077。六、统计学处理采用率的差别显著性检验。结果一、ATRA和db-cAMP对SMMC 7721细胞表面N-糖链在凝集素亲和层析柱上组分的影响SMMC-7721细胞经10 mol/L ATRA处理5 d后，表面N-糖链在Con A亲和层析柱上的Con A+组分比对照组明显增高(P0.05)，而Con A-和Con A+组

15、分显著减少(P0.05)。用0.5 mmol/L db-cAMP处理细胞5 d后，也有类似结果，唯Con A+增高和Con A-减少不及ATRA处理组明显，与对照组比较差别不显著(P0.05)；而Con A+下降则较为显著(P0.05)(见表1)。SMMC 7721细胞表面N-糖链在DSA柱上的层析行为，不论ATRA或db-cAMP处理，均可见DSA+组分比对照组减少(P0.05)(见表2)。表1ATRA和db-cAMP对SMMC 7721细胞表面N-糖链在Con A亲和层析柱上组分的影响分组3H标记糖链的cpm总数%Con A-Con A+Con A+对照65.1325.389.49ATRA

16、39.9955.434.58db-cAMP55.4541.333.22ATRA和db-cAMP的终浓度分别为10 mol/L和0.5 mmol/L，细胞处理5 d。Con A-：Con A不结合组分，用缓冲液A洗脱；Con A+：Con A弱结合组分，用含10 mmol/L -MM的缓冲液A洗脱；Con A+：Con A强结合组分，用含0.2 mol/L -MM的缓冲液A洗脱 表2ATRA和db-cAMP对SMMC 7721细胞表面N-糖链在DSA亲和层析柱上组分的影响分组3H标记糖链的cpm总数%DSA-DSA+对照77.6822.32ATRA85.9414.06db-cAMP91.168.

17、84ATRA和db-cAMP的终浓度和处理天数见表1。DSA-：DSA不结合组分，用缓冲液B洗脱；DSA+：DSA结合组分，用含1%二聚及三聚(11) N-乙酰氨基葡萄糖的缓冲液B洗脱 二、ATRA和PMA对HL-60细胞表面N-糖链在凝集素亲和层析柱上组分的影响HL-60细胞经1 mol/L ATRA处理3 d，表面N-糖链在Con A亲和层析柱上的Con A+组分也较对照组明显升高(P0.05)，而Con A-组分则明显降低(P0.05)。但与SMMC 7721细胞不同，Con A+组分显著增高(P0.05)而非降低。用1 mol/L PMA处理HL-60细胞3天后，其N-糖链在Con A

18、亲和层析柱上的各组分的改变也基本上和ATRA处理相仿，Con A+组分的增高也不及ATRA明显，与对照比较差别不显著(P0.05)(见表3)。当各处理组细胞表面糖链在DSA亲和层析柱上层析时，也可见DSA+组分比对照组减少(P0.05)。(见表4)。表3ATRA和PMA对HL-60细胞表面N-糖链在Con A亲和层析柱上组分的影响分组3H标记糖链的cpm总数%Con A-Con A+Con A+对照78.7813.7411.48ATRA17.1645.9336.91PMA28.0333.4238.55ATRA和PMA处理HL-60细胞的终浓度分别为1 mol/L和0.1 mol/L，细胞处理3

19、 d，Con A-，Con A+，Con A+组分的定义和洗脱条件同表1。 表4ATRA和PMA对HL-60细胞表面N-糖链在DSA亲和层析柱上组分的影响分组3H标记糖链的cpm总数%DSA-DSA+对照69.4939.51ATRA82.3517.65PMA76.4823.52ATRA和PMA处理HL-60细胞的终浓度分别为1 mol/L和0.1 mol/L，细胞处理3 d，DSA-，DSA+组分的定义和洗脱条件同表2。 讨论本文主要研究细胞表面N-糖链的结构变化，故采用3H-甘露糖标记糖链，因甘露糖只存在于N-糖链而不存在于糖脂及O-糖链，并且在3H标记N-糖链的制备时，增加了稀碱处理18

20、h这一步骤，也是为了避免O-糖链对凝集素亲和层析的可能干扰。根据Con A对N-糖链结合的结构专一性8，Con A+组分应为高甘露糖型或杂合型N-糖链，Con A+组分为不含平分型(bisecting)GlcNAc的C2C2二天线复杂型N-糖链，而ConA-组分包括三、四天线以及含有平分型GlcNAc的两天线复杂型N-糖链。经ATRA或db-cAMP处理SMMC 7721细胞后，Con A+组分增高而Con A-组分降低，说明二天线N-糖链增多而三、四天线糖链减少；又从DSA亲和层析发现，不论ATRA或db-cAMP处理均使DSA-组分增加而DSA+组分降低。根据DSA结合N-糖链结构的专一性

21、9，DSA-组分和DSA+组分分别为二天线和三/四天线复杂型N-糖链，故DSA亲和层析的结果同样表明ATRA或db-cAMP使二天线N-糖链增加而三/四天线N-糖链减少，这和Con A亲和层析的结果完全相符。以上结果提示，从二天线合成多天线N-糖链所需的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT)和的活力降低，这已被试验所证明10，虽然也有可能伴有合成平分型GlcNAc的糖基转移酶即GnT-降低，但事实并非如此，ATRA和db-cAMP均不能降低GnT-活力(待发表)。必需指出：每分子高甘露糖型和杂合型N-糖链含有较多的Man(高甘露糖型可有59个，而复杂型只有3个)，可参入较多的3H-Man，故这两类

22、N-糖链的实际含量%应低于表1中列出的含量%，甚至可能忽略不计，也即ATRA或db-cAMP可使SMMC 7721细胞的Con A+组分降低至几乎消失的程度。HL-60细胞经ATRA和PMA处理后，也可见Con A-组分明显降低而Con A+组分显著增高，这和ATRA或db-cAMP处理SMMC 7721细胞的结果相同。同样我室也已发现ATRA或PMA处理HL-60后GnT-的活力明显降低11，看来由GnT-表达降低引起的细胞膜表面二天线N-糖链增多而三/四天线N-糖链减少，也即N-糖链的分子量变小，是细胞分化较普遍的规律，这和细胞恶性转化时表面N-糖链分子量变大的结果12恰好相反，而且互相佐

23、证。但是，ATRA或PMA处理HL-60细胞后，细胞表面N-糖链中Con A+组分的变化与ATRA或db-cAMP处理SMMC 7721细胞相反，不是降低而是增高，说明高甘露糖型/杂合型N-糖链增多8。 Mizoguchi曾报道PMA诱导分化HL-60细胞后，表面N-糖链出现较多的的高甘露糖型13，这和作者的结果一致。然而，ATRA和PMA使HL-60细胞诱导分化的方向不同，ATRA使HL-60细胞分化成粒细胞4，而PMA使HL-60细胞分化成单核/巨噬细胞5。两者使HL-60细胞表面N-糖链结构的变化除了上述二天线都减少和高甘露糖型/杂合型都增多的相同点外，作者还发现有不同的一面，即ATRA

24、使N-糖链中平分型GlcNAc和合成该结构的GnT-减少，而PMA却使平分型GlcNAc和GnT-增高。由此可见，相同化合物(如ATRA)诱导分化不同肿瘤细胞时(如SMMC 7721细胞和HL-60细胞)，其表面N-糖链结构的变化不尽相同；同一细胞(如HL-60细胞)受不同化合物诱导分化时(如ATRA和PMA)，其表面N-糖链结构的变化也不完全相同。这为进一步研究细胞的恶性转化及分化逆转的分子机制提供了一些理论和实验依据。作者简介：赵家宏，男，博士研究生，讲师。作者单位：赵家宏（卫生部糖复合物重点实验室，上海医科大学生物化学教研室上海200032）李忠（卫生部糖复合物重点实验室，上海医科大学生

25、物化学教研室上海200032）董素才（卫生部糖复合物重点实验室，上海医科大学生物化学教研室上海200032）陈惠黎（卫生部糖复合物重点实验室，上海医科大学生物化学教研室上海200032）参考文献1陈惠黎.糖蛋白糖链和疾病C.见：陈惠黎主编.糖复合物结构和功能M.第1版.上海，上海医科大学出版社，1997：1042Ai ZW, Zha XL, Liu Y, Chen HL. Effect of retinoic acid on hepatocarcinoma cell lineJ. J Tumor Mark Oncol,1990,5:593Chai XY, Chen HL, Zhou XM, e

26、t al. Expression of oncogene during induced differentiation of human hepatocarcinoma cell lineJ.Chinese J Cancer Res,1994,6:34Breitman FR, Selonick SE, Collins SJ. Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic acidJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,77:29

27、365Koeffer HP, Bar-Eli M, Territo MC. Phorbol ester effect on differentiation of human myeloid leukemia cell line blocked at different stage of mutationJ. Cancer Res,1981,41:9196查锡良，艾兆伟，陈惠黎.系列植物凝集素柱层析法分析N-连接型糖链结构J. 生物化学与生物物理学报，1989，21：4317Ito Y, Seon N, Matsumoto I. Immobilization of protein ligands on new formyl-spancer-carrier for the preparation of stable and high capacity affinity adsorbentsJ. J Biochem,1985,95:16898Osawa T, Tsuji T. Fractionation and structural assessment of oligosaccharide and glycopeptide by use of immobilized l