生物化第一章后半ppt课件

1、第三节第三节 核酸的性质核酸的性质一、核酸的水解一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收性质三、核酸的紫外吸收性质四、变性、复性与杂交四、变性、复性与杂交1 1 酸水解酸水解碱水解碱水解酶水解酶水解一、核酸的水解一、核酸的水解核酸分子中的糖苷键核酸分子中的糖苷键 磷酸二酯键磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解可在酸或碱性条件下水解 1 1 酸水解酸水解 糖苷键和磷酸键都能被酸水解糖苷键和磷酸键都能被酸水解, ,糖苷糖苷键比磷酸键更容易键比磷酸键更容易 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶的对酸更不嘌呤碱的糖苷键比嘧啶的对酸更不稳定稳定, ,最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之最不稳定是嘌呤与脱氧

2、核糖之间的糖苷键间的糖苷键二、核酸的水解二、核酸的水解 2 2 碱水解碱水解 DNA DNA和和RNARNA对对碱的耐受程碱的耐受程度有很大差度有很大差别。别。二、核酸的水二、核酸的水解解 2 2 碱水解碱水解 DNA DNA和和RNARNA对碱的耐受程度有很大差别。对碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，室温条件下，DNADNA在碱中变性，但不在碱中变性，但不水解，水解，RNARNA水解。水解。 例如，室温条件下，在例如，室温条件下，在0.1 mol/L 0.1 mol/L NaOHNaOH溶液中，溶液中，RNARNA几乎可以完全水解；几乎可以完全水解；DNADNA在同样条件下则不受影响。在同

3、样条件下则不受影响。二、核酸的水解二、核酸的水解 二、核酸的水解二、核酸的水解 3 3 酶水解酶水解 磷酸二酯酶磷酸二酯酶: :非特异水解磷酸二酯键非特异水解磷酸二酯键 核酸酶核酸酶: :特异水解核酸的磷酸二酯键特异水解核酸的磷酸二酯键 按底物分类按底物分类: :脱氧核糖核酸酶和核糖脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶核酸酶 按底物作用的方式按底物作用的方式: :核酸外切酶和核核酸外切酶和核酸内切酶酸内切酶 双链双链DNADNA分子可以分子可以被上千种从微生物中被上千种从微生物中分离得到的限制性内分离得到的限制性内切酶切断切酶切断, , 又可以再又可以再连接起来。切断的过连接起来。切断的过程不需要能量，

4、而连程不需要能量，而连接的起来的过程却需接的起来的过程却需要要2 2个分子的个分子的ATPATP。这。这就是分子克隆和就是分子克隆和DNADNA重重组技术的基础。组技术的基础。大部分限制性大部分限制性内切酶识别的内切酶识别的碱基序列为碱基序列为4 4 6 6 个碱基的个碱基的palindrome palindrome 顺序。它们在顺序。它们在微生物细胞内微生物细胞内发挥的是防御发挥的是防御外来外来DNADNA入侵入侵的国防军的作的国防军的作用。用。二、核酸的酸碱性二、核酸的酸碱性质质碱基碱基核苷核苷核苷酸核苷酸OBO HO HO H2CPO HH OOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密

5、啶核糖核苷酸 O H2CPO HH OOOBO H脱氧核糖核苷酸碱基碱基adenine 4.15, 9.8cytosine 4.5, 12.2guanine 3.2, 9.6thymine 9.9, 13核苷核苷adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13核苷酸核苷酸AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4ADP 3.9,

6、6.3 : -CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0碱基碱基核苷核苷核苷酸核苷酸单核苷酸中单核苷酸中, 磷酸酯键中的磷酸基有二个解磷酸酯键中的磷酸基有二个解离常数离常数多核苷酸中多核苷酸中,除了末端一个磷酸基外除了末端一个磷酸基外, 磷酸二磷酸二酯键中的磷酸基只有一个解离常数酯键中的磷酸基只有一个解离常数核苷酸等电点核苷酸等电点 带负电荷带负电荷二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两

7、性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离，核酸的等电点比较低解离，核酸的等电点比较低DNADNA的等的等电点为电点为4-4.54-4.5，RNARNA的等电点为的等电点为2-2-2.5(2.5(低低) )。（核酸在其等电点时溶解度。（核酸在其等电点时溶解度最小）最小）核酸相当于多元酸，核酸相当于多元酸，pHpH大时，呈阴离大时，呈阴离子状态；子状态；-向阳极迁移向阳极迁移天然天然DNADNA与变性与变性DNADNA的滴定曲线是不同的滴定曲线是不同的的, ,双链解开后碱基即参与酸碱滴定双链解开后碱基即参与酸碱滴定 在核酸在在核酸在260 nm260 nm附近有最大吸收附近有最大吸收峰；据此特性可以

8、定性和定量检峰；据此特性可以定性和定量检测核酸。蛋白质在测核酸。蛋白质在280 nm280 nm有一定有一定的吸收峰，因此利用的吸收峰，因此利用D260/OD280D260/OD280比值可判断核酸样品的纯度。比值可判断核酸样品的纯度。四、紫外吸收四、紫外吸收 增色效应：天然增色效应：天然DNADNA分子从双螺旋结分子从双螺旋结构变为单链状态时，构变为单链状态时，它在在紫外光它在在紫外光260nm260nm波长处的吸收值明波长处的吸收值明显增加，此现象称显增加，此现象称为增色效应。为增色效应。RNARNA本身只有局部的双螺旋区，所以本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有变性行

9、为所引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。天然状态的天然状态的DNADNA在完全变性后，紫外在完全变性后，紫外吸收吸收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%.40%.而而RNARNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%1.1%。减色效应：核酸的减色效应：核酸的在在260nm260nm的光吸收的光吸收值通常比各核苷酸值通常比各核苷酸成分的光吸收之和成分的光吸收之和少少30%-40%30%-40%，这是，这是有规律的双螺旋结有规律的双螺旋结构中碱基紧密堆积构中碱基紧密堆积到一起造成的，此到一起造成的，此现象称为现象称为DNADNA减色减色效应。效应。* 四、变性、复

10、性与杂交四、变性、复性与杂交 是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋解开，变成无规则线团的现象。螺旋解开，变成无规则线团的现象。核酸变性其分子中的共价键并没有核酸变性其分子中的共价键并没有破坏，分子量也不改变，核酸的变破坏，分子量也不改变，核酸的变性（性（ denaturation ）( (一一)DNA)DNA的变性的变性DNADNA的变性的因素的变性的因素 温度升高；温度升高；酸碱度改变、酸碱度改变、 pH pH（11.311.3或或5.05.0）；）；有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；各种射线各种射线低离子浓度低离子浓度 A260A2

11、60值增加值增加粘度下降粘度下降分子量不变分子量不变DNADNA变性后的表现变性后的表现 DNA DNA热变性发生在热变性发生在一个很窄的温度范一个很窄的温度范围内，通常把热变围内，通常把热变性过程中光吸收达性过程中光吸收达到最大吸收完全到最大吸收完全变性一半双螺变性一半双螺旋结构失去一半旋结构失去一半时的温度称为该时的温度称为该DNADNA的熔点或熔解的熔点或熔解温度温度DNADNA的一个重要参数的一个重要参数- -熔解温度熔解温度Melting Temperature,TmMelting Temperature,Tm）：）：（一般（一般DNA的的Tm值在值在82-95C之间）之间） 影响影

12、响Tm Tm 的因素：的因素： 核酸的均一程度，均一性越高的样品，核酸的均一程度，均一性越高的样品，变性过程的温度范围越小。变性过程的温度范围越小。 Tm Tm与与G-CG-C含量成正比。含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44）- -特定的特定的条件下条件下 Tm Tm与介质离子强度与介质离子强度, ,成正比。成正比。 G-C含量与含量与Tm的关系的关系变性试剂可以使变性试剂可以使TmTm变低变低( (二二)DNA)DNA的复性的复性变性变性DNADNA在适当的条件下，两条彼此分开在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋

13、结构，的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性；这一过程称为复性；影响影响DNADNA的复性的因素的复性的因素分子量越大复性越难。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。浓度越大，复性越容易。DNADNA的复性需要一定的盐浓度，增的复性需要一定的盐浓度，增加盐浓度，复性速度加快加盐浓度，复性速度加快T1/2 Co const将热变性的将热变性的DNADNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNADNA不可能复性。即淬火。不可能复性。即淬火。但是将变性的但是将变性的DNADNA缓慢冷却时，可以复缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火性，这一过程也叫退火annealing) anne

14、aling) 退火温度退火温度TmTm2525（三）、分子杂交（三）、分子杂交 热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定单链，在复性时并不一定与同源与同源DNADNA互补链形成双螺旋结构，它互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源也可以与在某些区域有互补序列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构。这样形成的单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交新分子称为杂交DNADNA分子。分子。 DNA DNA单链与互补的单链与互补的RNARNA链之间也可以发生链之间也可以发生杂交。杂交。Southern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA杂交杂

15、交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA杂交杂交 PCR PCR技术技术核酸的杂交在分子生物学和遗传核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。学的研究中具有重要意义。分子杂交的种类分子杂交的种类Southern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA杂交杂交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA杂交杂交Western BlotWestern Blot：抗原：抗原- -抗体进行杂交抗体进行杂交原位杂交：活体组织上进行杂交，显原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光出荧光 第一

16、节第一节 核酸通论核酸通论 第二节第二节 核酸的结构核酸的结构 第三节第三节 核酸的物理化学性核酸的物理化学性质质 第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的超速离心核酸的超速离心 三三 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 四四 核酸的序列测定核酸的序列测定第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 ( (一一)DNA)DNA的分离的分离 （二（二RNARNA的分离的分离 ( (三三) ) 核酸定量测定核酸定量测定DNADN

17、A和和RNARNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA DNA核蛋白核蛋白 RNA RNA核蛋白核蛋白0.14mol/L NaCl - +0.14mol/L NaCl - + 1-2mol/L NaCl + - 1-2mol/L NaCl + -( (一一) DNA) DNA的提纯和纯化的提纯和纯化目前分离目前分离DNADNA方法：方法： 盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白 SDS/CTAB SDS/CTAB 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心注意：用高温注意：用高温180180

18、度或度或DEPCDEPC处理处理 加入加入RNasinRNasin( (二二) RNA ) RNA 的提纯和纯化的提纯和纯化DNADNA和和RNARNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA DNA核蛋白核蛋白 RNA RNA核蛋白核蛋白0.14mol/L NaCl - +0.14mol/L NaCl - + 1-2mol/L NaCl + - 1-2mol/L NaCl + -( (三三) ) 定量测定定量测定 紫外分光光度法紫外分光光度法- 定磷法定磷法 定糖法定糖法 定磷法定磷法: : 磷含量相

19、对恒定磷含量相对恒定, , (RNA9.4%; DNA 9.9%)(RNA9.4%; DNA 9.9%) 有机磷有机磷 水解水解成无机磷成无机磷用浓硫酸或过氯酸用浓硫酸或过氯酸磷酸磷酸+ +钼酸钼酸 磷钼酸磷钼酸酸性条件酸性条件还原剂还原剂钼蓝钼蓝660nm660nm光密度与磷含量成正比光密度与磷含量成正比定糖法定糖法 ( (核酸含糖核酸含糖) ) 糠醛糠醛+ +甲基苯二酚甲基苯二酚( (地衣酚地衣酚) )鲜绿色鲜绿色( (最大最大670nm)670nm)RNA +RNA +盐酸盐酸加热加热糠醛糠醛FeCl3FeCl3催化剂催化剂DNA(DNA(在酸性溶液中在酸性溶液中)+)+二苯胺二苯胺加热

20、加热蓝色化合物蓝色化合物 ( (最大最大595nm)595nm)第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的超速离心核酸的超速离心 三三 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 四四 核酸的序列测定核酸的序列测定 超速离心可以分离超螺旋超速离心可以分离超螺旋DNADNA密度大）密度大） , ,线性线性DNADNA密度小和闭环密度小和闭环DNADNA密度居中）。也可以分离密度居中）。也可以分离RNARNA。-最常用的是分离真核生物的染色体最常用的是分离真核生物的染色体DNADNA与线粒体与线粒体 叶绿体叶绿体DNADNA分开分开; ;

21、超速离心超速离心 沉降速度沉降速度沉降常数沉降常数 S S 密度梯度密度梯度三三 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 A A：琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳 B B：聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳 通常，琼脂糖通常，琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰或聚丙烯酰胺胺 (polyacrylamide)凝胶被用于核酸的凝胶被用于核酸的分离研究、鉴定和纯化分离研究、鉴定和纯化DNA分子。也可分子。也可以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。琼脂糖从红色海藻琼脂中提取的良好电琼脂糖从红色海藻琼脂中提取的良好电泳介质，是泳介质，是D-和和L-半乳糖残基通过半乳糖残基通过和和糖

22、苷键交替构成的一种线状聚合物，琼脂糖苷键交替构成的一种线状聚合物，琼脂糖凝胶可以构成一个直径从糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于到略大于200nm的三维筛孔的通道。其密度由琼脂的三维筛孔的通道。其密度由琼脂糖的浓度决定。糖的浓度决定。A A：琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳A A 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物以琼脂糖为支持物 操作简单、快速，且分离范围广操作简单、快速，且分离范围广 DNADNA在琼脂糖凝胶的迁移速度在琼脂糖凝胶的迁移速度 1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦 系数成反比的系数成反比的2、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比

23、、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比3、DNA的构型：超螺旋的构型：超螺旋I）、环状）、环状II）、）、 线状线状III）4、所用的电压、所用的电压 一般不大于一般不大于5V/cm,一定范围一定范围 内呈正比内呈正比5、电泳缓冲液、电泳缓冲液 溴化乙锭溴化乙锭(ethidiumbromide，简称，简称EB)是一是一种核酸染料，可以插入到种核酸染料，可以插入到DNA或或RNA分子的碱基之间，并在分子的碱基之间，并在260nm波长的紫外光照射下放射出橘红色波长的紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现凝胶中的核酸的荧光，可用来显现凝胶中的核酸分子。分子。在凝胶电泳中，溴化乙锭染料在凝胶电泳中，

24、溴化乙锭染料可对核酸分子染色，在紫外光下便可对核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测出凝胶可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中介质中DNA谱带。谱带。安全警示：安全警示：EB是一种强的是一种强的DNA诱变剂，使用时尽量避免触及皮肤。诱变剂，使用时尽量避免触及皮肤。电泳时有时使用到较高的电压，要电泳时有时使用到较高的电压，要小心触电。小心触电。DNA的凝胶电泳检测的凝胶电泳检测 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测 +-仪器仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品药品 Agarose、 loading buffer、 TBE b

25、uffer、 EB溴化乙锭）溴化乙锭）;上样缓冲液上样缓冲液6X配方配方 0.25% 溴酚蓝、溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、二甲苯氰醇、 40%蔗糖；水溶液蔗糖；水溶液4保管。保管。PCR扩增结果分析举例扩增结果分析举例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.聚丙烯酰胺凝胶：在由聚丙烯酰胺凝胶：在由TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)催化过硫酸胺还原产生的自由

26、催化过硫酸胺还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线形长链，在交联剂丙烯酰胺的线形长链，在交联剂N，N-亚甲双亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯酰胺丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯酰胺的交联链形成三维带状网格结构，链长和交联的的交联链形成三维带状网格结构，链长和交联的程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离DNA的能力。的能力。B 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶制胶一般将琼脂糖凝胶制胶一般将EB直直接加入接加入而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能将染料加入，会影响聚合。将染料加入，会影响聚合。1000bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2DAP 6DAP 12DAP第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的超速离心核酸的超速离心 三三 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 四四 核酸的序列测定核酸的序列测定 四序列测定四序列测定 1 DNA 1 DNA酶法测序酶法测序 2 DNA 2 DNA的化学法测序的化学法