人参皂苷溶血作用规律及其注射剂溶血成分研究

1、人参皂苷溶血作用规律及其注射剂溶血成分研究    0 引言人参皂苷是五加科人参属人参（Panax ginseng C.A.Meyer）、西洋参（Panax quinquefoliumL.）和三七（Panax notoginseng）的主要活性成分，目前，已经确定的人参皂苷有40 多种。溶血是皂苷的特性之一，多种皂苷具有溶血作用，致使皂苷类注射剂产生溶血副作用，这也是限制皂苷类注射剂广泛应用的最大障碍之一1。一般认为皂苷的溶血是其与血红细胞壁上的胆甾醇结合生成不溶性分子复合物沉淀，造成血红细胞正常渗透性被破坏而发生崩解2。人参总皂苷并没有显示明显的溶血作用

2、2，但经分离纯化后的单体皂苷却分别具有截然相反的溶血和溶血保护作用，而且其溶血和溶血保护作用的强弱和浓度之间存在着近似的曲线关系3。皂苷的溶血作用强弱通常采用溶血指数表示，上世纪70 年代日本学者难波恒雄通过体外溶血实验对7 种单体皂苷的溶血特性进行了测定4。由于测定溶血度方法很多5-7，并且如反应体系的温度、药物浓度、反应时间等因素均会对溶血度造成较大的影响，因此有关含皂苷类中药的溶血反应的测定尚未见统一标准。目前，含皂苷类成分尤其是人参皂苷的中药注射剂临床应用较普遍，如血塞通注射剂的主要成分是三七总皂苷，经测定，血塞通注射剂中人参皂苷-R1，人参皂苷-Rb1，人参皂苷-Re，人参皂苷-Rg

3、1 和人参皂苷-Rd 含量较高，为主要皂苷成分。此类注射液在应用中的一个重要问题是产生溶血不良反应。因此建立此类注射剂中溶血性成分的判定方法有利于控制其溶血不良反应的发生。我们首先规范了皂苷溶血评价体系，然后对人参皂苷的单体及相互作用引起的溶血反应的机理进行研究。同时，以血塞通注射液为研究对象，运用统计学方法对血塞通注射液中引起溶血反应的物质进行分析。0.1 实验材料0.1.1 仪器和动物Sartorius CP225D 型精密天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），TDZ4-WS 低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），Matrix 移液器，Thermo 可调式移液器（热电仪器有限公司）

4、，UV-2100 紫外分光光度计（上海UNICO 公司），U-3010 紫外分光光度计（日本日立公司），Agilent 1100 series 高效液相色谱仪（美国安捷仑科技有限公司），PHS-3C 型精密数显酸度计（上海康宁电光技术有限公司），Motic BA200 数码显微镜（厦门麦克奥迪实业集团），家兔（购于大连大学实验动物中心）。0.1.2 试剂氯化钠注射液（赤峰荣济堂药业有限责任公司生产批号10020011），磷酸盐缓冲溶液（简称PBS）自制，人参根部总皂苷样品自制，血塞通注射液购于各医药公司，Rg1 标准品（中国药品生物制品检定所）；甲醇，乙腈等试剂购于天津市科密欧化学试剂有限公司

5、。1 人参皂苷溶血条件的确定目前主要测定注射剂溶血的方法有目视比色法、显微细胞计数法和分光光度法。中国药典主要采用第一种方法，我们通过实践发现这种方法不能给出定量关系。第二种方法精密度较差，而且费时、费力。而第三种方法具有较好的精密度和重现性。因此我们确定了第三种方法。通过对溶血实验有影响的几个因素（最大吸收波长、血细胞保存条件、血细胞浓度、水浴时间、离心速度、离心时间、反应体系pH 值）进行考查，参照文献8建立最优的溶血实验评价方法。如下：取2.5mL1.1%兔红细胞（全溶血吸光度值为1.0，溶液为生理盐水），加入不同浓度的药品溶液，以生理盐水定容6mL，37保温120min 后，3000r

6、/min离心10 分钟，取上清液，比色测定，检测波长575nm。溶血度（%）=（A 药品A 空白）/（A100%溶血A 空白）×100%。阳性对照组为2.5mL1.1%血细胞加入到蒸馏水，阴性对照组为2.5mL1.1%血细胞加入到生理盐水。同时对该方法的重现性及稳定性进行考察，其RSD 分别为1.66%及1.99%，表明本条件重现性良好。2 人参皂苷溶血规律研究2.1 对照皂苷（saponin）半数溶血浓度（HD50）值测定按照上述溶血度测定方法，在刻度离心管中分别加入不同浓度的Saponin 溶液。Saponin浓度的对数值（logC）为横坐标，溶血百分数（A%）为纵坐标，拟合对数

7、浓度溶血百分数曲线，并计算其半数溶血浓度（HD50），见Fig. 1。标准皂苷 Saponin 半数溶血浓度（HD50）为2.23g/ml。曲线表明Saponin 皂苷在浓度较低时溶血现象不明显，随着浓度的增加，溶血比例迅速增大，且在半数溶血时浓度的变化对溶血影响最为灵敏，直到血细胞全部发生溶血。2.2 单体人参皂苷溶血规律的测定2.2.1 人参皂苷半数保护量（P50）的测定在刻度离心管中加入不同浓度有抗溶血作用的人参皂苷溶液和一定浓度的Saponin 溶液（反应液中Saponin 的浓度为其HD50 即2.23g /mL），按照上述方法测量溶血度。保护皂苷浓度（C）或其浓度的对数值（logC

8、）为横坐标，抗溶血百分数（记为PA%，PA%=1-A%）为纵坐标，计算半数保护浓度（P50）。2.2.2 人参皂苷半数溶血量（HD50）的测定采用上述方法测定不同人参皂苷的半数溶血浓度，结果见Tab. 1。Saponin 被认为是具有强溶血作用的混合皂苷，在本实验中作为对照皂苷。由于曲线上通过HD50 或 P50 所对应点的切线斜率最大，即皂苷浓度在HD50 或 P50 附近变化时对溶血结果影响最大，故选取半数浓度作为皂苷溶血或抗溶血作用强弱的指标。我们将Saponin 半数溶血浓度所产生溶血的效果设定为其他人参皂苷溶血或抗溶血作用测定时溶血或抗溶血的上限值，即溶血或抗溶血作用的最大值等于对照

9、皂苷HD50 浓度造成的溶血度值。由于此上限值随着操作误差大小变化较灵敏，可通过准确把握这个标准值来确保对实验操作准确性的监测。两种截然相反的作用结果用同一标准作对照表示出来，这使得单体人参皂苷溶血或抗溶血作用的强弱在数值上具有了一定的可比性。几种人参皂苷的溶血作用和抗溶血作用曲线都具有相似的S 形关系曲线，与文献报道的曲线近似4，提示人参皂苷的溶血和抗溶血作用机理相似或相同。2.2.3 溶血与抗溶血单体皂苷相互作用与溶血效果的关系1）在10 支刻度离心管中均加入同一浓度的Rd 和不同浓度的Rc，混合均匀后再加入1.1%的红细胞悬浊液1.25mL，使三者体积之和为6mL 并且Rd 的浓度为35

10、0g/mL（接近其HD50 值），Rc 的浓度分别为09g/mL，浓度跨度为其P0P100 值。按照测定方法，以不含皂苷的阴性实验组上清液为空白，Rc 的浓度为0 的实验组为100对照，紫外分光光度计575nm 测定吸光度并计算溶血度。2）在10 支刻度离心管中均加入同一浓度的Rd 和不同浓度的Rg1，混合均匀后再加入1.1%的红细胞悬浊液1.25mL，使三者体积之和为6mL 并且Rd 的浓度为350g/mL（接近其HD50 值），Rg1 的浓度分别为0400g/mL，浓度跨度为其P0P100 值。按照测定方法，以不含皂苷的阴性实验组上清液为空白，Rg1 的浓度为0 的实验组为100对照，紫外

11、分光光度计575nm 测定吸光度并计算溶血度。人参皂苷相互作用相互作用引起的红细胞溶血特性进行研究结果显示Rc 在1g/mL 的浓度（对Saponin 无保护作用）即可起到对Rd 半数溶血浓度的保护作用。而Rg1 的浓度为400g/mL 时（对Saponin100保护作用）仍未起到对Rd 半数溶血浓度的保护作用，而且有随浓度增大而助溶血的不明显趋势。3 血塞通注射剂主要成分含量的测定3.1 血塞通注射剂含量测定的方法学考察3.1.1 色谱条件经方法学考查确定色谱条件为：色谱柱：phenomenex C18 柱 (4.6mm×250mm，5m)。流动相：A，水；B，乙腈。梯度洗脱：0-

12、12min，19B；12-60min，19-36B；60-75min，36%-50%B；75-85min，50%-65%B。流速：1.0ml/min。柱温:25。进样量:5l。紫外检测波长:203nm。3.1.2 供试品和标准品的制备供试品的制备：取同一批次的血塞通注射液5 支混匀，用0.45m 微孔滤膜过滤，取续滤液备用。标准品的制备：精密称取R1，Re，Rg1，Rb1 及Rd，以色谱甲醇作溶剂，配制成1mg/mL的溶液，用0.45m 微孔滤膜过滤，取续滤液备用。3.1.3 实验结果根据各峰面积计算含量如下：4 血塞通注射剂溶血规律研究4.1 血塞通注射剂的分离取同一批次血塞通注射液50 支

13、 (约含三七总皂苷5g)，蒸干，用硅胶进行柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，合并，得到5 个馏分，记为A-E。4.2 血塞通注射液溶血浓度测定上述方法测定血塞通注射液的HD50，其中8 号为阴性对照组，9 号阳性对照组。并计算溶血度。4.3 正交设计法探讨血塞通注射剂溶血作用的规律4.3.1 供试品溶液的配制馏分A不能单独溶解在生理盐水中，故精密称取A、B馏分按照原注射剂中的比例混合后作为一个因素，配置成4mg/mL的溶液。精密称取馏分C、D和E，定溶，配置成4mg/mL的溶液。吡碇溶液不超过3%。4.3.2 注射剂中皂苷组分比例不同时溶血度的考察取22组实验，1-16组中，每组分别加入注射剂溶

14、液、馏分A+B、馏分C、馏分D、馏分E、生理盐水和2.5mL的1.1%的血细胞悬浮液，使每组总体积为6ml。17-20组只考察注射剂对溶血度的影响；21和22组分别为未加入皂苷的阴性对照组和全溶血的阳性对照组，测量其溶血度，4.3.3 皂苷含量和溶血度的量效关系考查1) 馏分A+B、C、D和E溶液的配置精确称取馏分A馏分B，配置成3.3mg/mL的溶液备用。精称馏分C、D、E，定容，分别配置成1.2、0.9及5.0mg/mL溶液备用。2) 皂苷和溶血度的量效关系考查取24个实验组，按Tab.5 加入各馏分，测量各组的溶血度。3) 馏分B、C、D和E溶液的配置精确称馏分B、C、D、E，定容配置成

15、8.1、4.0、2.5及25mg/mL的溶液备用。4) 加入馏分B、C、D和E考察皂苷和溶血度的量效关系按Tab.6 加入各馏分，考察不同馏分比例对溶血度的影响。5) HPLC法测定各实验组组分浓度综合上表，按与上述实验方法相同浓度配比，用色谱甲醇代替生理盐水为溶剂，依照血塞通注射液液相色谱条件，进样量为10L，进行HPLC定量分析，得到各峰面积并计算浓度值。4.4 实验数据处理血塞通注射液中多种皂苷的含量视为自变量，溶血度视为应变量，利用统计分析的手段研究多种皂苷含量的变化与溶血度之间的线性关系。多种成分的浓度数据在EXCEL 中进行平方项和相关项处理，即分别计算出x12，x22xn2 和x

16、1*x2，x1*x3xn-1*xn。4.5 数据统计分析4.5.1 相关分析分别以单体浓度溶血度及单体化合物所占总皂苷的百分含量溶血度的关系进行相关分析，结果得到以下结论。1）各单体化合物在反应体系中的浓度与溶血度的相关分析结果显示Rg1，Rg2，m51对溶血度有显著的正相关，m70对溶血度有正相关 (m51，m70分别代表在HPLC谱图中保留时间为51min，70min的微量成分)。即当上述4种单体成分的浓度增大时血红细胞的溶血度升高。2）各单体化合物所占总皂苷的百分含量与溶血度之间的相关分析结果显示，溶血度与R1、Re、Rb1、Rd所占总皂苷的百分含量呈现负相关，与Rg1、Rg2、m51及

17、m70所占总皂苷百分含量呈现正相关。即在上述浓度变化范围内R1、Re、Rb1、Rd百分含量越高则对红细胞保护溶血的作用越强，而Rg1、Rg2、m51及m70百分含量越高则对红细胞溶血的作用越强。3）采用上述两种统计指标对数据进行分析，具有一致性，同时结合单体人参皂苷溶血及抗溶血作用规律研究结果，结果显示采用相关分析统计的结果与实验结论基本相同。因此，可以确定血塞通注射液中Rg1、Rg2、m51 及m70 四种成分是引起注射液溶血的主要成分。4.5.2 多元线性回归统计对数据进行分析，由于本实验统计的是注射剂中成分变化对溶血度的影响，因此首先将各数据标准化，标准化公式为(X- x )/SD，采用

18、多元线性回归的逐步回归分析方法，拟合回归方程，在总体上模拟不同组分组成的注射液与其溶血度间的数量关系，确定自变量或自变量的组合对溶血产生的影响。用 SPSS 软件处理上标准化实验数据，得到了方差分析、T 检验、线性回归方程和判定系数等信息。统计结果如下：1）未经标准化的样本回归方程为Y=19.887+16.526m51+54.139Rg2-74.187Rg2*m71+6.957Rg1*m73-26.862R1+34.530Rg2*Rd，(Y 为溶血度)。由此看来决定注射剂溶血的因素既有含量较高的成分，又有含量较低的成分。从前面结论可以看出，-Rg2 本身由于半数溶血浓度较低，在溶血测定中起主要

19、作用。2）回归方程通过了总检验（根据方差分析表），因为F 统计量对应的P 值等于0，小于任何给定的显著性水平（最小的显著性水平为1%），所以拒绝所有回归系数同时等于零的假设，说明从整体上看，R1、Rd、Rg1、Rg2、m51、m71、m73 作为一个整体之间存在线性关系。3）m51、Rg2、Rg2*m71、Rg1*m73、R1、Rg2*Rd 它们的回归系数分别通过了t 检验，它们的t 统计量分别为4.989、6.012、-6.620、2.786、-2.953、2.269，对应的P 值分别为.000，.000.000、.010、.006、.032 小于任何给定的显著性水平，所以分别拒绝两个回归系

20、数等于零的假设。4）从标准化的回归系数（经标准化回归系数是把所有的变量标准化以后，再应用OLS估计得到的系数）可以看出，在得到的六个自变量中，按照Rg2*m71，Rg2，Rg2*Rd，R1，m51，Rg1*m73 的顺序对溶血度的影响按从大到小排列。说明Rg2 对溶血度Y 值的正向影响最大，而Rg2*m71 对对溶血度Y 值的负向影响最大。5）未经调整的判定系数等于84.1%，说明在溶血度的变动中有84.1%是由m51、Rg2、Rg2*m71、Rg1*m73、R1、Rg2*Rd 的变动导致的。经调整后的判定系数为80.6%，其意义和解释与未经调整的判定系数相同，一般情况下后者会小于前者。估计标

21、准误差为10.4842661，方程显著性概率sig=0.032<0.05，为显著。5 结论1. 通过对溶血实验有影响的几个因素进行考查，建立最优的溶血实验评价方法，方法简述如下：取2.5mL1.1%兔红细胞（全溶血吸光度值为1.0，溶液为生理盐水），加入不同浓度的药品溶液，以生理盐水定容6mL，37保温120min 后，3000r/min 离心10 分钟，取上清液，比色测定，检测波长575nm。溶血度（%）=（A 药品A 空白）/（A100%溶血A 空白）×100%。此方法测定的溶血度的稳定性及重复性的RSD 分别为1.66%及1.99%，表明该方法稳定及重现性良好。目前中国药

22、典采用目视比色法，方法误差和人为因素较大，而且不能量化。建议采用分光比色法考查注射剂半数溶血浓度作为注射剂溶血控制指标。2. 通过多种人参皂苷的溶血和溶血保护特性的研究，发现人参单体皂苷的溶血作用规律如下：1）皂苷可分为溶血性皂苷和抗溶血性皂苷两类；2）溶血性皂苷在高浓度具有溶血作用，低浓度具有抗溶血作用；3）高浓度不溶血的皂苷（抗溶血皂苷），低浓度都具有一定的溶血保护作用；4）含糖较少的皂苷溶血性较强。3. 对影响注射剂溶血的因素进行研究，总结如下：1）皂苷类成分一般在高浓度具有溶血特性，低浓度具有溶血保护特性。皂苷类注射剂本身可以引起注射剂溶血，尤其是浓度较高情况下；2）注射剂辅料也可引起

23、溶血，当pH 值等因素变化时，尤其明显。4. 皂苷类注射剂溶血是一个复杂体系，皂苷和辅料都可以引起溶血。就皂苷本身而言，在控制溶血的关键因素中既有含量较高的成分，又有含量较低的成分，同时由于皂苷相互作用引起的溶血反应并非是单体皂苷作用的加减，因此通过改变注射剂中单体皂苷浓度，通过统计方法分析可确定血塞通注射液中溶血的相关因素。本方法简便实用，具有其他实验方法不能比拟的优势。溶血性因素的确定对于进一步注射剂的不良反应控制具有重要意义。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量药学论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！参考文献 (References)1 孟勤，孙平，王陆黎，等. 人参、西

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25、Beijing: China Traditional Chinese Medicine Press,2003.3 TSUNEO N, MASAO Y, TSUYOSHI T, etc. Fundamental studies on the evaluation of the crude drugs(III)chemical and biochemical evaluation of ginseng and related crude drugsJ. Yakugaku Zasshi. 1974, 94(2): 252260.4 TSUNEO N, MASAO Y, TSUYOSHI T, et al. Fundamental studies on the evaluation of the crude drugs(I)hemolytic and its protec