应用分支DNA技术及SqRT_PCR方法检测结直肠癌患者腹腔

1、【文章编号】1007-9424(201002-0165-05论著应用分支DNA技术及SqR T2PCR方法检测结直肠癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞王浩斌1,王崇树1,张才全2,谢贤雍3【摘要】目的探讨分支DNA(b2DNA及半定量R T2PCR(SqR T2PCR在结直肠癌术中腹腔冲洗液中游离癌细胞检测中的应用。方法分别采用基于b2DNA信号放大的基因表达定量检测技术及SqR T2PCR方法检测48例结直肠癌患者术中腹腔冲洗液中CEA mRNA的表达,同时行腹腔冲洗液细胞学检查(peritoneal lavage cytolo2 gy,PL C,收集12例结直肠良性病变患者的腹腔冲洗液为阴性对照

2、,GA PD H mRNA为内参对照。结果b2DNA技术和SqRT2PCR方法检测游离癌细胞的阳性率(43.8%,31.3%较PL C的检出率(4.2%高(P<0.01。结直肠癌患者腹腔冲洗液中CEA mRNA的相对表达量均与肿瘤分化程度、浆膜侵犯程度和Dukes分期有关(P<0.05,而与肿瘤大小、患者性别、年龄无关(P>0.05。结论b2DNA技术和SqR T2PCR方法检测游离癌细胞各有优缺点;腹腔内游离癌细胞的存在与结直肠癌临床病理因素有关。【关键词】结直肠肿瘤;肿瘤微转移;分支DNA;半定量反转录2聚合酶链反应;癌胚抗原【中图分类号】R735.34;R73237【文

3、献标识码】ADetecting Free C ancer C ells in Peritoneal C avity of Colorectal C ancer P atients by B ranched2Chain DNA and SqRT2PCR W A N G H ao2bin1,W A N G C hong2shu1,Z HA N G C ai2quan2,X I E X ian2yong3. 1.T he Fi rst Department of General S urgery,T he A f f iliated Hos pital of N orth S ichuan Medi

4、cal College,N anchong637000,S ichuan Province, China; 2.T he T hi rd Department of General S urgery,T he Fi rst A f f iliated Hos pital,Chongqing Universit y ofMedical Sciences,Chongqing400016,China; 3.De partment of Pat hology,T he A f f iliated Hos pital of N orth S ichuan Medical College,N anchon

5、g637000,S ichuan Province,ChinaCorres ponding A uthor:W A N G C hong2shu,E2mail:chongs2w ang【Abstract】ObjectiveTo evaluate branched2chain DNA(b2DNAsignal amplification and semi2quantitative (SqR T2PCR in detection of f ree cancer cells in peritoneal flushing fluid of colorectal cancer patients durin

6、g surger2 y.MethodsThe CEA mRNA in peritoneal flushing fluid in48cases of colorectal cancer were detected by b2DNA and SqRT2PCR.Peritoneal flushing fluid cytology(PL Cwas conformed simultaneously to detect the f ree cancer cells.The peritoneal flushing fluid of12cases with colorectal benign disease

7、were taken as negative control,G APDH mRNA as internal control.R esultsIn colorectal cancer patients,positive rate of f ree cancer cells by b2DNA and SqR T2PCR(43.8%,31.3%was higher than that by PL C(4.2%.The relative quantitative expressions of CEA mRNA were related to the Dukes staging,depth invas

8、ion and differentiation degree(P<0.05,but irrelevant to tumor size,the patientsage and gender(P>0.05.ConclusionBoth b2DNA and SqR T2PCR technologies have ad2 vantages and disadvantages to detect f ree cancer cells in peritoneal flushing fluid,which are related to clinicopatho2 logical factors.

9、【K ey w ords】Colorectal cancer;Tumor micrometastasis;Branched2chain DNA;semi2quantitative real time2 polymerase chain reaction;Carcinoembryonic antigen【Found ation item】Application Basic Research Program of Sichuan Science and Technology Agency(No.04J Y029201523【基金项目】四川省科技厅应用基础研究项目(项目编号:04J Y0292015

10、23【作者单位】1.川北医学院附属医院普外一科(四川南充637000;2.重庆医科大学附属第一医院普外三科(重庆400016;3.川北医学院附属医院病理科(四川南充637000【通讯作者】王崇树,E2mail:chongs2wang【作者简介】王浩斌(1983年-,男,山西省太原市人,硕士研究生,住院医师,主要从事胃肠道肿瘤的基础与临床研究,E2mail:haohao2008. student。结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,临床上约有50%患者根治术后出现肿瘤复发和转移,其中腹腔内种植占20%1,而腹腔内的游离癌细胞(free cancer cells,FCC则是发生腹腔种植转移的先决条件。因

11、此,早期清除脱落于腹腔的FCC是防止腹腔内复发、转移的关键。寻找特异、敏感的检测FCC 的方法具有重要临床意义,本研究选用癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA为肿瘤标志物,采用基于分支DNA(b2DNA信号放大的基因表达定量检测技术和半定量R T2PCR(SqR T2PCR方法间接检测结直肠癌患者腹腔冲洗液中的FCC,并比较2种方法的优缺点。1资料和方法1.1临床资料收集川北医学院附属医院2008年12月至2009年4月期间48例结直肠癌手术患者的腹水或腹腔冲洗液,其中男30例,女18例,年龄32 78岁,平均55岁。病理类型:管状腺癌36例,乳头状腺癌2例,印戒

12、细胞癌2例,黏液腺癌8例。管状腺癌癌细胞分化程度:高分化20例,中分化10例,低分化6例。Dukes分期:A期7例,B期14例, C期20例,D期7例。淋巴转移27例,远处转移7例,肉眼腹膜播散3例。所有患者病灶均位于腹膜返折以上。收集同期12例经手术治疗结直肠良性肿瘤患者腹腔冲洗液作为阴性对照,其中结直肠息肉4例,管状腺瘤3例,绒毛状腺瘤5例。上述患者的诊断均经病理学证实。人结肠癌细胞株SW480(引自美国,由重庆医科大学病理学教研室常规培养为阳性对照,管家基因GA PD H为内参对照2,3。1.2腹水及腹腔冲洗液的收集和保存手术均用电刀开腹,剖腹后注意保护皮肤,用腹壁切口保护器防止皮肤切口

13、的上皮细胞及渗血进入腹腔,进腹后用大块纱布遮盖小肠,有腹水者即从盆腔抽取腹水。若无腹水,则向腹腔内注入温生理盐水200ml冲洗肿瘤所在局部腹腔,并轻微搅动, 24min后抽出,腹水及腹腔冲洗液均需离心、PBS 液洗涤。将离心标本分为3份:第1份做细胞涂片,H E染色后行细胞学检查;第2份加入去RNA 酶缓冲液,-80存放,待作b2DNA基因定量检测;第3份立刻用Trizol法提取RNA,经凝胶电泳检测RNA的完整性后放入-80冰箱保存以备R T2PCR检测。1.3细胞学检查(PLC将送检的冲洗液或腹水进行离心(2800×g 5min后,取离心沉淀物涂片,H E染色,镜检,由2位经验丰

14、富的病理学专家阅片,发现癌细胞即为阳性。1.4b2D NA技术检测CEA mRNA表达使用Quanti Gene2.0样本处理试剂盒(美国Panomics公司中的特定裂解液将样本裂解后使总RNA释放出来,步骤按照试剂盒说明进行。将总RNA分别加入96孔板的每个孔中,每孔加10l,捕获板的每个孔中加入50l稀释的CEA和GA PD H mRNA探针试剂(美国Panomics公司设计并合成,将96孔板放入恒温箱中使RNA和探针进行过夜杂交(1620h从而捕获mRNA,温度须控制在(55±1。捕获的mRNA与b2DNA进行杂交可使信号放大400倍,然后加入化学发光底物,在多功能酶标仪(美国

15、Bio2Tek公司下检测发光信号。根据Quanti Gene2.0试剂说明,首先计算出最低检出量(limit of detection,LOD,LOD=背景控制孔的化学发光信号平均值(AV G RL U back2 ground-3×背景控制孔化学发光信号的标准差(3×SD background。通过多功能酶标仪检测目的基因测试孔的信号检出值,若高于LOD则为表达阳性,低于LOD则为表达阴性。以GA PD H mRNA的标准化平均相对光单位值(AV G RL U作为校正基数,即目的基因mRNA的相对表达量= (AV G RL U目的基因mRNA-AV G RL U back

16、2 ground/(AV G RL U看家基因-AV G RL U back2 ground。1.5SqRT2PCR检测CEA mRNA表达将提取的总RNA进行逆转录,按照逆转录试剂盒说明(美国Promega公司进行,反应条件: 3010min,5530min,995min,15个循环。提取细胞cDNA进行PCR扩增:引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成,CEA 上游引物:52TCT GGAACT TCTCC T GGTC TC2 TCA GCT GG23,下游引物:52T GTA GC T GT T G2 CAAA T GCT T TAA GGAA GAA GC23,扩增产物长度

17、为131bp。内参照GA PD H上游引物:52 CCCA TCACCA TC T TCCA GG23,下游引物52 CA TCACGCCACA GT T TCCC23,扩增产物长度为379bp。扩增条件:9410min,9430s,5630s,7230s,40个循环;72延伸2min,冷却至4。取5l扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳45min,经凝胶成像系统(美国Bio2Rad公司分析DNA条带的密度,通过比较样品间目的基因与内参基因的PCR产物密度比值来评价不同样品的基因表达差异,CEA mRNA相对表达量=CEA mRNA 吸光度值/GA PD H mRNA吸光度值。1.6统计学处理采用SP

18、SS16.0统计学软件,定量表达结果用均数±标准差( x±s表示,组间比较计量资料采用t 检验,计数资料采用2检验。检验水准=0.05。2结果2.1SqRT2PCR检测结果在紫外线灯下,CEA mRNA扩增呈阳性者可见长度为131bp的条带,无此条带者为阴性。对照组中检出1例CEA mRNA阳性表达,其余均为阴性表达,见图1。2.2细胞学检查、b2D NA技术及SqRT2PCR检测方法的比较结果b2DNA技术及SqR T2PCR方法检测结直肠癌患者腹腔FCC的检出阳性率43.8%(21/48, 31.3%(15/48均高于PLC法4.2%(2/48,差异有统计学意义(P&l

19、t;0.01。b2DNA技术与SqR T2 PCR的检出阳性率差异无统计学意义(P>0.05,但应用b2DNA技术多检出6例阳性患者 。图1SqR T2PCR检测CEA mRNA在标本中的表达情况。M: Marker;A:结肠癌细胞株SW480(阳性对照;B、C、D:结直肠癌腹腔冲洗液,其中B、C呈阳性;E、F、G:结直肠良性病变腹腔冲洗液(阴性对照,其中E、F呈阴性;H:空白对照Fig.1The result s of CEA mRNA expressions detected by SqR T2PCR.M:Marker;A:Colon cancer cell line SW480(p

20、ositive control;B,C and D:Peritoneal flushing fluid of colorectal cancer, where B,C positive;E,F and G:Peritoneal flushing fluid of benign colorectal disease(negative control,where E and F negative;H: Blank control2.3b2D NA技术和SqRT2PCR检测结果与临床病理因素的关系采用b2DNA技术及SqR T2PCR方法定量检测结直肠癌患者腹腔中癌细胞CEA mRNA的相对表达量与

21、腺癌分化程度、浆膜侵犯和Dukes分期有关(P<0.05,而与肿瘤大小、患者性别、年龄无关(P> 0.05,见表1。表1b2D NA技术及SqRT2PCR方法检测CEA mRNA表达结果与临床病理因素的关系T able1The relationship bet w een the expressions of CEA mRNA detected by b2D NA and SqRT2PCR and clinicop athological factors临床病理因素Clinicopat hological factorb2DNA阳性数(例Positive case(case相对值(

22、 x±sRelative value( x±st值t valueP值P valueSqR T2PCR阳性数(例Positive case(case相对值( x±sRelative value( x±st值t valueP值P value性别(Gender男(Male140.718±0.109100.561±0.0681.3980.179 1.1940.254女(Female70.778±0.03750.600±0.029年龄(岁 Age(year60<6010110.727±0.1230.730&#

23、177;0.0880.0710.944780.558±0.0740.589±0.0441.0100.331肿瘤大小(cmTumor size(cm570.733±0.10560.566±0.0580.1400.8900.4490.661>5140.726±0.10690.580±0.064腺癌分化程度Differentiation degreeof adenocarcinoma高分化Well differentiated20.523±0.01410.515±0.0003.5340.012 3.5240.035

24、中低分化Moderately or poorlydifferentiated60.757±0.08940.710±0.059浆膜侵犯Serosal invasion有(Yes180.758±0.075140.583±0.0523.5890.002 2.4360.030无(No30.561±0.05410.453±0.000Dukes分期Dukes stagingA+B50.564±0.05220.489±0.0519.8860.000 2.5520.024C+D160.780±0.040130.587&#

25、177;0.0513讨论结直肠癌术后复发、转移与否直接影响着患者5年生存率,识别游离在腹腔冲洗液中的微量癌细胞,其目的在于判断患者术后复发、转移的危险性,从而有针对性地对患者进行辅助治疗4,提高5年生存率。虽然,通过常规的细胞学检查在腹腔冲洗液中发现癌细胞预示着患者术后较低的生存率5,6,这已成为一个金标准,但由于PL C易受腹腔内间皮细胞的干扰,敏感性低、漏诊率高,一些PL C 检测阴性的患者术后仍出现腹膜播散。本研究中PL C的阳性检出率仅为4.2%(2/48,因此,我们认为在临床工作中不能单独采用此法。本研究中采用b2DNA技术及SqR T2PCR方法均是通过测定患者腹水或腹腔冲洗液中最

26、为公认的消化道恶性肿瘤标志物CEA mRNA的表达来检测腹腔FCC的存在7,8。由于腹腔内存在大量RNA酶,结直肠癌细胞溶解破坏所释放的CEA mRNA立即被降解,因此所检测到的腹腔冲洗液中CEA mRNA可视为来自腹腔内播散的存活癌细胞,这些存活癌细胞具备种植转移的能力。而细胞学仅能反映细胞的形态,无法反映癌细胞的存活状态,更无法反映癌细胞的内部特征9。本研究中采用b2DNA技术和SqR T2PCR方法不仅可灵敏检测腹腔内的微量FCC,其阳性检出率远高于PL C,而且能用相对定量反映不同样本癌细胞数量的差异。SqR T2PCR方法有如下优点10:若选择适当的靶RNA,则敏感性和特异性均较高;

27、能反映标本的整体情况,而细胞学和免疫组化仅能反映标本的局部情况。其缺点11是:SqR T2PCR反应受多个因素影响,如硫酸镁的浓度、引物退火的温度、扩增的循环数等,对技术要求高,且相对定量是在PCR反应的终点检测产物凝胶电泳条带密度,不能正确反映扩增前的实际比值,故该法准确性有限,只能用于粗略比较样品间的基因表达水平。我们分析假阳性产生的可能原因:CEA在白细胞中有非特异性表达12,13,本研究中采用2种方法在阴性对照组中均检出1例CEA mRNA表达阳性,考虑可能为此原因;标本采集时上皮细胞的污染;PCR扩增条件的不当;非特异性细胞低水平的非法转录。假阴性产生的原因可能为RNA易被腹腔内广泛

28、存在的RNA酶降解。因此,SqR T2PCR在检测肿瘤微转移存在一定的局限性。基于b2DNA信号放大的基因表达定量检测技术可克服SqR T2PCR方法的种种不确定因素,无需抽提纯化RNA,无需逆转录,无需PCR扩增,对样本量下限无要求,灵敏度高(每孔有50个拷贝数即可得到阳性结果,只需将样本用特定裂解液裂解后,经探针杂交和信号放大(可放大400倍即可迅速得到精确的定量结果14217。本研究中采用b2DNA技术检测48例结直肠癌患者腹腔冲洗液中CEA mRNA的表达阳性率为43.8%(21/48, SqR T2PCR的表达阳性率为31.3(15/48,比SqR T2PCR多检出6例。但b2DNA

29、技术检测费用较高,有待进一步改进。综上所述,基于b2DNA信号放大的基因定量检测技术和SqR T2PCR方法检测腹腔冲洗液中CEA mRNA的表达来间接检测结直肠癌患者腹腔内的FCC是可行的,且2种方法各有优缺点,但b2 DNA技术较SqR T2PCR操作更为简单,且影响因素少,其相对定量结果更为可靠、精确。但本研究为小样本量研究,今后还需扩大样本量来更进一步证实其研究结果。4参考文献1Akasu T,Sugihara K.Solitary peritoneal metastasis from co2lon carcinomaJ.Surgery,1998;124(5:9382940.2Suzu

30、ki T,Higgins P J,Crawford DR.Control selection for RNAquantitationJ.Biotechniques,2000;29(2:3322337.3Barber RD,Harmer DW,Coleman RA,et al.GA PD H as ahousekeeping gene:analysis of GA PD H mRNA expression ina panel of72human tissuesJ.Physiol Genomics,2005;21(3:3892395.4李立.结直肠癌外科应用技术的规范与创新(十五J.中国普外基础与

31、临床杂志,2008;15(3:2152217.5Yamamoto S,Akasu T,Fujita S,et al.Long2term prognos2tic value of conventional peritoneal cytology after curative re2section for colorectal carcinomaJ.Jpn J Clin Oncol,2003;33(1:33237.6Noura S,Ohue M,Seki Y,et al.Long2term prognostic val2ue of conventional peritoneal lavage cy

32、tology in patient s un2dergoing curative colorectal cancer resectionJ.Dis ColonRectum,2009;52(7:131221320.7Japink D,Leers MP,Sosef MN,et al.CEA in activatedmacrophages.New diagnostic possibilities for tumor markersin early colorectal cancerJ.Anticancer Res,2009;29(8:324523251.8Prochot sky A,Okolican

33、y R,Sekac J,et al.Diagnosis andmanagement of local and locoregional recurrence of colorectalcarcinomaJ.Bratisl Lek Listy,2009;110(9:5692573.9Katoh H,Yamashita K,Sato T,et al.Prognostic signifi2cance of peritoneal tumour cells identified at surgery for colo2rectal cancerJ.Br J Surg,2009;96(7:7692777.

34、 10肖梅,周宁新,高丽杰,等.半定量检测胆管癌组织中人fxyd6基因的表达J.中国普外基础与临床杂志,2008;15(2:83287.11Freeman WM,Walker S J,Vrana KE.Quantitative R T2PCR:pitfalls and potentialJ.Biotechniques,1999;26(1:1122122.12Nakanishi H,K odera Y,Yamamura Y,et al.Rapid quanti2tative detection of carcinoembryonic antigen2expressing freetumor ce

35、lls in t he peritoneal cavity of gastric2cancer patient swit h real2time R T2PCR on t he lightcyclerJ.Int J Cancer,2000;89(5:4112417.13骆成玉,赵丹宁,李世拥,等.大肠癌患者腹腔微量游离癌细胞的研究J.中华外科杂志,2001;39(6:4332436. 14Canales,RD,L uo Y,Willey J C,et al.Evaluation of DNAmicroarray result s wit h quantitative gene expressi

36、on plat2formsJ.Nat Biotechnol,2006;24(9:111521122. 15Knudsen BS,Allen AN,Mclerran DF,et al.Evalluation ofbranched2chain DNA assay for measurement of RNA in for2malin2foxed tissuresJ.J Mol Diaqn,2008;10(2:1692176.16Berrodin TJ,J elinsky SA,Graciani N,et al.Novel proges2terone receptor modulators wit

37、h gene selective and context2dependent partial agonismJ.Biochem Pharmacol,2009;77(2:2042215.17Lee AC,Dai Z,Chen B,et al.Electrochemical branched2DNA assay for polymerase chain reaction2free detection andquantification of oncogenes in messenger RNAJ.AnalChem,2008;80(24:940229410.(2009207224收稿,2009210220修回(本文编辑孟文建【文章编号】1007-9424(201002-0169-01病例报告恶性腹膜间皮瘤合并十二指肠淤积症1例报道赵红雲1,张霞1,谢微