Nω-硝基-L-精氨酸甲酯可抑制吗啡镇痛耐受大鼠的痛觉过敏以

1、N-硝基-L-精氨酸甲酯可抑制吗啡镇痛耐受大鼠的痛觉过敏以及脊髓和中脑的谷氨酸释放（作者单位：薛富善，许亚超，刘毅，杨泉涌，张国华，李成文，刘鲲鹏，孙海涛：100041 北京市，中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院麻醉科。于玲：100044，北京市，北京大学人民医院麻醉科）薛富善 于玲 许亚超 刘毅 杨泉涌 张国华 李成文 刘鲲鹏 孙海涛摘要：目的 在福尔马林炎性疼痛模型观察非特异性一氧化氮合成酶（NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）对吗啡镇痛耐受大鼠疼痛行为以及脊髓和中脑细胞外谷氨酸含量的影响。方法 将2

2、4只健康成年Sprague-Dawley大鼠随机平均分为4组（每组6只）：1组为对照组，在项背部皮下注射生理盐水 1 ml；2组、3组和4组为处理组，分别皮下注射L-NAME 20 mg/kg、吗啡 10 mg/kg、L-NAME 20mg/kg和吗啡10 mg/kg。各组的皮下注射处理均为每天2次，连续7天。在第8天上午最后1次皮下注射后30 min，于大鼠左后掌皮下注射5%福尔马林0.1 ml，记录其每5 min内舔咬注射足时间,观察时间为50 min。记录完毕后断头取脊髓和中脑测定细胞外谷氨酸含量。结果 与1组相比，2组的相舔咬注射足时间显著缩短，3组的相和相舔咬注射足时间显著延长，4组

3、的相和相舔咬注射足时间均显著缩短。与1组相比，脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量在2组显著降低，在3组则显著增高；虽然4组脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量较3组显著降低，但是却显著高于1组。结论 吗啡镇痛耐受大鼠接受福尔马林炎性刺激后表现为痛觉过敏，脊髓和中脑的谷氨酸含量增加；L-NAME可减轻其痛觉过敏，并抑制脊髓和中脑谷氨酸的释放。本研究结果提示脊髓和中脑的一氧化氮系统和谷氨酸的释放与吗啡镇痛耐受时痛觉过敏的发生密切相关。关键词：痛觉过敏，吗啡，一氧化氮合成酶抑制剂，谷氨酸（作者单位：薛富善，许亚超，刘毅，杨泉涌，张国华，李成文，刘鲲鹏，孙海涛：100041 北京市，中国医学科学院中国协和医科大学整

4、形外科医院麻醉科。于玲：100044，北京市，北京大学人民医院麻醉科）本文作者薛富善教授的通讯地址和电子邮箱：100041 北京市，中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院麻醉科；Fruitxue；电话-nitro-L-arginine Methyl Ester Inhibits Hyperalgesia and glutamate release in rats with morphine analgesia toleranceXue Fushan，Yu Ling，Xu Yachao，et al. Department of Anesthesiology，Pla

5、stic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100041 CHINA. Abstract：Objectives The purposes of this study were to observe the effects of systemic administration of nonspecific nitric oxide synthase inhibitor，N-nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME

6、），on pain behavior and the extracellular concentrations of glutamate in spinal cord and midbrain induced by formalin in rats with morphine analgesia tolerance. Methods 24 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly allocated equally to 4 different groups （n=6）. Group 1，the control group，received

7、 a subcutaneous （s.c.） injection of 1 ml NS; Group 2，3 and 4，the treatment groups，received s.c. injection of L-NAME 20 mg/kg，morphine 10 mg/kg，and L-NAME 20 mg/kg and morphine 10 mg/kg，respectively. All rats received s.c. injection twice a day. Thirty minutes after last treatment administration in t

8、he morning of the 8th day，0.1 ml of 5% formalin was injected subcutaneously into the plantar surface of the left hindpaw. The total time spent licking injected-paw （TTSLI） within every 5 min was recorded for 50 min thereafter. Animals were decapitated after pain behavior observation. The spinal cord

9、 and midbrain were sampled to measure glutamate concentration by high-performance liquid chromatography （HPLC）. Results As compared to group 1，TTSLI in phase decreased significantly in group 2，TTSLI in phases and increased significantly in group 3 and decreased significantly in group 4. The HPLC res

10、ults suggested that the extracelluer concentrations of glutamate in spinal cord and midbrain induced by formalin were significantly lower in group 2 but higher in group 3 as compared to group 1，and those were significantly lower in group 4 as compared to group 3. Conclusions Formalin stimulation mig

11、ht elicit hyperalgesia in rats with morphine analgesia tolerance and result in significant increases in glutamate concentrations of spinal cord and midbrain. L-NAME could attenuate hyperalgesia and decrease glutamate concentrations of spinal cord and midbrain. Based on the results of this study，it i

12、s concluded that nitric oxide system and glutamate release in spinal cord and midbrain are closely related to development of hyperalgesia in morphine analgesia tolerance.Key words: hyperalgesia，morphine，nitric oxide synthase inhibitor，glutamate研究发现，吗啡镇痛耐受时中枢神经系统发生的细胞内和细胞外改变与中枢敏感化时相似1。谷氨酸是一种兴奋性神经递质，它

13、参与兴奋性突触传递，并与突触的可塑性有关。目前认为谷氨酸引起的脊髓神经元敏感化在炎性疼痛的敏感状态中发挥着重要作用2。一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种重要的神经信息物质，越来越多的证据表明NO在吗啡镇痛耐受形成中具有重要作用。已经证实，NO和谷氨酸在中枢神经系统的作用可以双向调节，两者的产生和释放可以互相促进7。研究发现，吗啡镇痛耐受大鼠在受到伤害性刺激时表现为痛觉过敏和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）表达增强，并且全身应用NOS抑制剂可以抑制吗啡镇痛耐受的形成3-6。但是，至今尚无研究揭示NO和谷氨酸在吗啡镇痛耐受个体痛觉过敏中的作用。因此，

14、本研究在福尔马林炎性疼痛模型观察了非特异性一氧化氮合成酶（NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）对长期应用吗啡大鼠疼痛行为以及脊髓和中脑细胞外谷氨酸含量的影响，旨在探讨NO和谷氨酸在吗啡镇痛耐受个体痛觉过敏发生中的作用，为临床上解决吗啡镇痛耐受这一难题提供有益的启示。材料和方法实验试剂 盐酸吗啡（沈阳第一制药厂生产，批号020909）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）（美国Sigma公司，批号N-5751），17种氨基酸标准品、AccQ.Tag衍生试剂、AccQ.Tag A溶液和乙腈均是购于美国Waters

15、公司。配制流动相用水为重蒸馏水；其他试剂为优质纯或化学纯。实验动物和分组 本研究采用北京医科大学实验动物中心提供的健康纯种成年Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘（清洁级实验动物，封闭群），体重20020g。将24只大鼠随机平均分为4组（每组6只）：1组为对照组，在项背部皮下注射生理盐水 1 ml；2组、3组和4组为处理组，分别皮下注射L-NAME 20 mg/kg、吗啡10 mg/kg、L-NAME 20mg/kg和吗啡10 mg/kg。各组前7天的皮下注射处理均为每日2次（8：00和17：00），第8天上午8：00进行最后一次皮下注射。在第8天给药后30 min于大鼠左后掌皮下组织内

16、注射5%福尔马林0.1 ml，记录其舔咬注射足时间。记录完毕后断头取材，采用高效液相色谱法（HPLC）测定脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量。另外，取6只未接受任何处理的大鼠断头取脊髓和中脑，测定其细胞外谷氨酸含量作为未受伤害性刺激的正常大鼠的标准值。目的是为实验中细胞外谷氨酸含量的结果提供参考值。疼痛行为的评估 在大鼠左后掌皮下注射福尔马林后，立即将其放入一特制实验笼内观察并记录50 min。实验笼采用透明有机玻璃制成，体积为30cm30cm30cm，其下部装有一面与地面成45角的镜子以利于观察。记录每5 min内舔咬注射足的累计时间（s）。所采用的行为学指标是舔咬注射足的持续时间。观察结果分为2

17、个时期：第一时相（相）（010 min）和第二时相（相）（1550 min）。脊髓和中脑细胞外谷氨酸含量测定 本研究采用高效液相色谱法测定脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量，具体步骤如下：取大鼠脊髓或中脑组织30 mg，加入4无水乙醇1 ml，4下手动匀浆器充分匀浆。匀浆液离心20 min（4，18 000 r/min）。采用直径为0.22m的一次性滤膜过滤，采用移液管移取100l样品，-20下保存待测。按照试剂盒说明，配制AccQ.Flour衍生试剂并衍生，进样10l。色谱条件：柱温37；紫外检测波长248 nm；A液：按1：10（V/V）稀释的AccQ.Tag A溶液：B液：100%乙氰。流动相

18、在使用前均放在超声波清洗器中超声脱气1 min。全程45 min。统计学处理 所有数据采用均数标准差（s）表示。采用SPSS 10.0统计学软件进行分析。采用重复测量方差分析对数据进行统计学处理。以P0.05作为判断差异显著性的标准。结果疼痛行为的变化 结果见表1和图1。注射福尔马林后，1组即对照组大鼠出现了明显的舔咬注射足行为。与1组相比，2组的相舔咬注射足时间无显著改变（P0.05），相舔咬注射足时间显著缩短（P0.01）。3组大鼠的舔咬注射足行为较1组更明显，其相和相舔咬注射足时间分别较1组显著延长23%和50%（P0.01）。与1组相比，4组的相和相舔咬注射足时间均显著缩短（P0.01

19、）。脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量 结果见表2。与1组相比，福尔马林刺激后脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量在2组显著降低（P0.05），在3组显著增高（P0.01）。虽然4组脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量较3组显著降低（P0.05），但却显著高于1组（P0.05）。大鼠相舔咬注射足时间与脊髓和中脑细胞外谷氨酸含量的相关系数分别为0.87和0.86（P0.05）。讨论福尔马林炎性刺激是一种持续性伤害刺激，既往研究证实，在注射浓度为1%和5%的福尔马林之后，小鼠表现为急性（相）和慢性（相）疼痛行为，随着注射的福尔马林浓度增加，两相疼痛行为均增强8。本研究显示，在大鼠左后掌皮下注射5%福尔马林0.1 ml后

20、其产生了典型的相和相疼痛行为。与对照组相比，长期注射L-NAME（2组）可抑制福尔马林炎性刺激的相疼痛行为，但对相疼痛行为无影响。这可能是与相和相疼痛行为的机制不同有关。已经证实，相疼痛行为主要是直接刺激伤害性感受器所致；相疼痛行为则主要是由N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体激活和不同种类兴奋性氨基酸释放所致9，10。作为一种非特异性NOS抑制剂，L-NAME可抑制NO的合成，而NO对NMDA受体的功能则具有调节作用。既往研究发现，NOS抑制剂不仅可抑制由NMDA引起的热痛觉过敏，而且亦可抑制福尔马林炎性刺激的相疼痛行为11，12。据报道，每天2次

21、给大鼠应用吗啡10 mg/kg，连续应用5天即可使其出现吗啡镇痛耐受现象5。本研究是每天2次给大鼠皮下注射吗啡10 mg/kg，连续应用7天，其目的是使大鼠产生吗啡镇痛耐受。结果发现，长期应用吗啡大鼠（3组）在第8天注射福尔马林后出现了更明显的疼痛行为，其相和相疼痛行为的持续时间分别较对照组延长23%和50%，提示大鼠对福尔马林炎性刺激产生了痛觉过敏，这与既往研究结果相一致13。吗啡镇痛耐受大鼠出现的痛觉过敏可能与其脊髓后角神经元处于潜在过敏状态有关14，15。既往研究证实，在大鼠后爪注射福尔马林可诱发脊髓释放谷氨酸16。本研究结果亦支持该结论。与未受伤害性刺激的正常大鼠相比，在对照组大鼠后爪

22、注射福尔马林后50 min时，其脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量分别增加了45%和50%。作为一种兴奋性氨基酸，谷氨酸主要是通过与NMDA受体结合而发挥作用。研究发现，福尔马林炎性刺激可使NMDA受体兴奋，Ca2+内流进入神经元17，从而激活NOS而使NO生成增加。NO作为一种“逆行性”递质又可弥散至其他神经元的突触前膜介导NMDA受体的许多作用，并且NO和谷氨酸释放可相互促进7，16。本研究发现，长期应用L-NAME的大鼠在接受福尔马林刺激后其相疼痛行为的持续时间显著缩短，并且脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量较对照组显著降低。这些结果提示L-NAME抑制伤害性刺激的作用可能是通过抑制脊髓和中脑NO合

23、成而减少谷氨酸释放和干扰NMDA受体功能实现的。本研究表明，在吗啡镇痛耐受大鼠注射福尔马林后，其相和相疼痛行为均显著强于对照组，说明其产生了痛觉过敏，同时大鼠脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量显著增高，并且谷氨酸含量与大鼠的疼痛行为表现呈正相关。这些结果提示脊髓和中脑谷氨酸释放增加在吗啡镇痛耐受大鼠的痛觉过敏形成中具有重要作用。注射福尔马林后吗啡镇痛耐受大鼠脊髓和中脑谷氨酸浓度异常升高的细胞内机制可能是与阿片类物质下调谷氨酸转运蛋白的功能有关18。已经证实，兴奋性氨基酸在突触后的异常释放、NMDA受体激活以及NO弥散至相邻神经元引起谷氨酸释放增加以及这些机制之间形成的正反馈过程等，均在痛觉过敏形成中

24、发挥着重要作用19，20。本研究结果表明，联合应用L-NAME可抑制吗啡镇痛耐受大鼠接受福尔马林炎性刺激后所出现的痛觉过敏，并降低其脊髓和中脑细胞外谷氨酸含量。这些结果说明脊髓和中脑NO合成、NMDA受体激活和谷氨酸释放及其相互作用亦与吗啡镇痛耐受大鼠痛觉过敏的形成密切相关。综上所述，吗啡镇痛耐受大鼠接受福尔马林炎性刺激后表现为痛觉过敏，并且脊髓和中脑的细胞外谷氨酸含量增加；联合应用L-NAME可抑制吗啡镇痛耐受大鼠的痛觉过敏，并减少脊髓和中脑细胞外谷氨酸的释放。这提示脊髓和中脑的NO合成、NMDA受体激活和谷氨酸释放及其相互作用在吗啡镇痛耐受大鼠痛觉过敏形成中发挥着关键作用。参考文献1.Ma

25、o J，Mayer DJ. Spinal cord neuroplasticity following repeated opioid exposure and its relation to pathological pain. Ann N Y Acad Sci，2001；933：175-84.2. Vetter G，Geisslinger G，Tegeder I. Release of glutamate，nitric oxide and prostaglandin E2 and metabolic activity in the spinal cord of rats following

26、 peripheral nociceptive stimulation. Pain，2001；92（1-2）：213-8.3.Pataki I，Telegdy G. Further evidence that nitric oxide modifies acute and chronic morphine actions in mice. Eur J Pharmacol，1998；357（2-3）：157-62.4.Liang DY，Clark JD. Modulation of the NO/CO-cGMP signaling cascade during chronic morphine

27、exposure in mice. Neurosci Lett，2004；365（1）：73-7.5.Majeed NH，Przewlocka B，Machelska H，Przewlocki R. Inhibition of nitric oxide synthase attenuates the development of morphine tolerance and dependence in mice. Neuropharmacology，1994；33（2）：189-92.6.于玲，薛富善，李成文，等. N-硝基-L-精氨酸甲酯抑制吗啡镇痛耐受大鼠中脑和脊髓一氧化氮合成酶/N-甲基

28、-D-天冬氨酸受体表达上调. 生理学报，2006；58(6):593-598.7.Watanabe C，Okuda K，Sakurada C，Ando R，Sakurada T，Sakurada S. Evidence that nitric oxide-glutamate cascade modulates spinal antinociceptive effect of morphine：a behavioural and microdialysis study in rats. Brain Res，2003；990（1-2）：77-86.8.Rosland JH，Tjolsen A，Ma

29、ehle B，Hole K. The formalin test in mice：effect of formalin concentration. Pain，1990；42（2）：235-42.9.Davidson EM，Coggeshall RE，Carlton SM. Peripheral NMDA and non-NMDA glutamate receptors contribute to nociceptive behaviors in the rat formalin test. Neuroreport，1997；8（4）：941-6.10.Malmberg AB，Gilbert

30、H，McCabe RT，Basbaum AI. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T. Pain，2003；101（1-2）：109-16. 11.Wang H，Nei H，Zhang RX，Qiao JT. Peripheral nitric oxide contributes to both formalin- and NMDA-induced activation of

31、nociceptors：an immunocytochemical study in rats. J Neurosci Res，1999；57（6）：824-9.12.Malmberg AB，Yaksh TL. Spinal nitric oxide synthesis inhibition blocks NMDA-induced themal hyperalgesia and produces antinociception in the formalin test in rats. Pain，1993；54（3）：291-300. 13.Li X，Angst MS，Clark JD. A

32、murine model of opioid-induced hyperalgesia.Mol Brain Res，2001；86（1-2）：56-62.14.Rohde DS，Detweiler DJ，Basbaum AI. Formalin-evoked Fos expression in spinal cord is enhanced in morphine-tolerant rats. Brain Res，1997；766（1-2）：93-100.15.Li X，Angst MS，Clark JD. Opioid-induced hyperalgesia and incisional

33、pain. Anesth Analg，2001；93（1）：204-9.16.Lawand NB，McNearney T，Westlund KN. Amino acid release into the knee joint：key role in nociception and inflammation. Pain，2000；86（1-2）：69-74.17.Malmberg AB，Yaksh TL. Cyclooxygenase inhibition and the spinal release of prostaglandin E2 and amino acids evoked by paw formalin injection：a microdialysis study in unanesthetized rats. J Neurosci，1995；15（4）：2768-76.18.Wen ZH，Chang YC，Cher