大肠菌群及大肠杆菌检测方法

1、出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexportSN016992代替 ZBX09002861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2 设备和材料2.1 吸管：1mL,具 0.1mL 刻度；5mL 和 10mL,具 1mL 刻度。22 水浴箱：44.565C。2.3 培养箱：361C,44.5B5C。2.4 冰箱：05c 和-15-20C。2.5 均质器。2.6 乳钵和研

2、棒。2.7 平皿：直径 90mmo2.8 天平：感量 0.1g。2.9 显微镜。2.10 稀释瓶：100mL、200mL 和 500mL 三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约 5mmo2.12 菌落计数器。3 培养基及试剂1月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤。1煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。1EC 肉汤。1伊红美蓝琼脂（EMB）o1营养琼脂斜面。1色氨酸肉汤。1MR-VP 培养基。1Korser 氏枸椽酸盐肉汤。1结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。1Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。1生理盐水。1革兰氏染色液。1Kovacs 氏靛基质试剂。1甲基红指示剂。1Vogesproska

3、uer（VP）试剂。4 样品制备以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用 75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C 保存；非冷冻而易腐的食品，应置于 4c 冰箱保存。检验前冷冻本品可于 25C18h 内解冻，或在 45c以下 15min 内解冻。不同食品样品匀液的制备1液体食品以灭菌吸管取样 25mL 放入装有 225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以 30cm 幅度、于 7s内振摇 25 次（或以机械振荡器振摇），制成 1:10 的样品匀液。1固体和半固体食品以无菌操作取 25g 样品，放入装有 225mL 稀释剂的灭菌均质杯内，于 800

4、0r/min 均质 12min,制成 1:10 样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如 10-2、10-3、10-4.。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过 15min。5 大肠菌群的测定大肠菌群 MPN 值的测定攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤，每管接种 1mL。攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀将接种管置于 361C 培养 48+2ho攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产

5、生，记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。如所有 LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。大肠菌群的证实试验攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀将所有产气管用直径为 3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀置 BGLB 肉汤管于 36?C 培养 482h。攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。攀挀 挀昀戀 愀搀 愀 攀攀结果报告：按 BGLB 肉汤产气管数，查 MPN 表（见附录 B（补充件）报告每克（毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。6 粪大肠菌群测定用直径为 3mm 的接

6、种环将所有 48h 内产气的 LST 肉汤管培养物移种于 EC 肉汤管中。将所有接种的 EC 肉汤管在 30min 内放入带盖 44.505C 水浴箱内，培养 24&h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为 44.5C 产气阳性的大肠杆菌和 44.5C 不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。记录 EC 肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。结果报告：按产气管数，查 MPN 表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的 MPN 值。7 大肠杆菌测定将 6.3 条中的 EC 肉汤管继续培养 24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝

7、（EMB）平板，36?C 培养24+2ho检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，361C 培养 1824h。将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。色氨酸肉汤：在 361C 培养 242h 后，力口 Kovacs 氏试剂 0.20.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。MRVP 培养基；在 361C 培养 482h。以无菌操作移取培养物 1mL 至 13mm100mm 试管中，力口 5%a蔡酚乙醇溶液 0.6mL,40%氢氧

8、化钾溶液 0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置 2h,如出现伊红色，为 VP 试验阳性。将 MRVP 培养物的剩余部分再培养 48h 滴加 5 滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。Koser 氏枸椽酸盐肉汤：于 361C 培养 96h 记录有无生长。LST 肉汤：于 301C 培养 482h,观察试管中是否产气。革兰氏染色：取 18h 营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质 MRVP 枸椽酸盐鉴定（型别）+-典型大肠杆菌+非典型中间型+典型产气肠杆菌+非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型，表

9、明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC 试验为+-或-+-,再根据 LST肉汤阳性管数查 MPN 表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌 MPN 值。8 大肠菌群固体培养基测定法样品制备同第 4 章。计数选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿 1mL。另取 lmL 稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。8.2.2 将冷至 4510.5C 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）1015mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后，再加 34mLVRBA 覆盖平板表

10、层。翻转平板，置于 36lC 培养 1824h。选用有 30150 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。证实从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，移种于 BGLB 肉汤管内，361C 培养 24h 和 48h,观察产气情况。将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。结果报告经最后证实为阳性（产气，革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于 8.2.5 条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4

11、样品稀释液 lmL,在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10X104/g（mL）=6.0X05/g（mL）附录 A培养基和试剂（补充件）A1 月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤胰蛋白或胰酪月东（Trypticase）20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾 (K2HPO4)2.75g磷酸二氢钾 (KH2P04)2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸储水 1000.0mL将各成分溶解于蒸储水中。分装到有倒立发酵管的 20mrW150mm 试管中，每管 10mL。121c 高压灭菌 15mi

12、n最终 pH6.80.2。+-+-+-+非典型大肠杆菌+典型中间型A2 煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤蛋白腺 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉（oxgall 或 oxbile）溶液 200.0mL0.1%煌绿水溶液 13.3mL蒸储水将蛋白月东乳糖溶于约 500mL 蒸储水中，加入牛胆粉溶液 200mL（将 20.0g 脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸储水中，pH7.07.5）,用蒸储水稀释到 975mL,调 pH7.4。 再加入 0.1%煌绿水溶液 13.3mL,用蒸储水补足到 1000mL,用棉花过滤后， 分装到 20mrWl50mm 试管 （管内有倒立的小发酵管）中，每管 10mL。121c

13、 高压灭菌 15min。最终 pH7.20.1。A3EC 肉汤胰蛋白或胰酪20.0g3 号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾（KH2P04）4.0g磷酸二氢钾（KH2P04）1.5g氯化钠 5.0g蒸储水 1000.0mL将以上成分溶解于蒸储水中，分装 16mrW150mm 试管（管内有倒立的小发酵管），每管 8mL。121c 高压灭菌 15min,最终 pH6.91。A4 伊红美蓝琼脂（EMB）蛋白腺 10.0g乳糖 10.0g磷酸氢二钾（KH2P04）2.0g琼脂 15.0g伊红丫水溶性）0.4g 或 2%水溶液 20mL美蓝 0.065g 或 0.5%水溶液 13mL蒸储水

14、 1000.0mL在 1000mL 蒸储水中煮沸溶解蛋白月东、 磷酸盐和琼脂， 加水补足至原量。 分装于三角烧瓶中。 每瓶 100mL 或 200mL,高压灭菌 15min。最终 pH7.110.2。使用前将琼脂融化，于每 100mL 琼脂中加 5mL 灭菌的 20%乳糖水溶液、2mL 的 2%伊红丫水溶液和 1.3mL0.5%的美蓝水溶液，摇匀，冷至 4550c 倾注平皿。A5 营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白腺 5.0g琼脂 15.0g蒸储水 1000.0mL将各成分加于蒸储水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121c 高压灭菌 15min。最终 pH7.30.1。灭菌后摆成斜面备用。A6 色

15、氨酸肉汤胰月东或胰酪腺 10.0g蒸储水 1000.0mL加热搅拌溶解胰月东或胰酪腺于蒸储水中。分装试管，每管 5mL。121c 高压灭菌 15min。最终 pH6.90.2。A7MR-VP 培养基月东7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g蒸储水 1000.0mL将各成分溶于蒸储水中，分装试管，121c 高压灭菌 15min,最终 pH6.90.2。A8Koser 氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢镂钠（NaNH4HPO4?4H2O）1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g硫酸镁（MgSO4?7H2O）0.2g枸椽酸钠（含 2H2O）3.0g蒸储水 1000.0mL将各成分溶解于蒸储水

16、中，分装试管，每管 10mL,121c 高压灭菌 15min。最终 pH6.70.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）蛋白腺 7.0g酵母膏 3.0g乳糖 10.0g氯化钠 5.0g胆盐或 3 号胆盐 1.5g中性 0.03g结晶紫 0.002g琼脂 1518g蒸储水 1000.0mL将上述成分溶于蒸储水中，静置几分钟，充分搅拌，调至 pH7.40.1。煮沸 2min,将培养基冷 4550c 倾注平板。临用时制备，不得超过 3hoA1OButterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液磷酸二氢钾（K2HPO4）34.0g蒸储水 500mL将磷酸二氢钾溶于蒸储水中， 用 lmol/L 氢氧化

17、钠约 175mL 调至 pH7.2。 用蒸储水加至 1000mL 贮存于冰箱。 稀释液取贮存液 1.25mL,用蒸储水稀释至 1000mL,分装于合适容器后，121c 高压灭菌 15min。A11 生理盐水氯化钠 8.5g蒸储水 1000.0mL将氯化钠溶于蒸储水中，121c 高压灭菌 15min。A12 革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫 1.0g95%乙醇 20.0mL1%草酸镂水溶液 80.OmL将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸镂溶液混合。革兰氏碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g蒸储水 300.0mL将碘与碘化钾先行混合，加入蒸储水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸储水至沙黄复染液：沙

18、黄 0.25g95%乙醇 10.0mL蒸储水 90.0mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸储水稀释。染色法a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min,水洗。b.滴加革兰氏碘液，作用 lmin,水洗。c.滴加 95%乙醇脱色约 1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d 滴加复染液，复染 lmin,水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A13Kovacs 氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛 5.0g戊醇 75.0mL盐酸(浓)25.0mL将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A14 甲基红指示剂甲基红 0.1g95%乙醇 300mL将甲基红溶解于 300mL 乙醇中，加水稀释至 500mL。A15VogesProskauer(VP)试剂甲液a-蔡酚 5.0g无水乙醇 100.0mL乙液氢氧化钾 40.0g用蒸储水加 100.0mL附录 B1g 检样中最近似值(MPN)表(补充件)使用三管法，接种量分别为 0.1,0.01 和 0.00lg。阳性管数MPN阳性管数MPN0.10.010.0010.10.010.0010001100注：本表采用 3 个稀释度0.1g(mL)、0