培养基质量保证与质量控制ppt课件

1、培育基质量保证与质量控制培育基制备指南(SN/T1538)简介李卫华山西出入境检验检疫局技术中心微生物检测的定义n在特定的环境下无菌，采用适当的方法对样品中目的微生物进展增殖和培育，并对经放大后的目的微生物进展感官、生理、生化等方面的特性分析和断定，以确定样品中目的微生物的量和/或质的特性的过程。微生物检测涉及的要素n检测人员n检测阅历和判别才干n检测设备n保证目的菌种的生长的外部环境n菌种试剂n保证目的菌种生长的内部环境n检测方法n选择适宜目的菌种检测的方法n测试环境n保证操作过程不受外界干扰维护样品和人员培育基的质量保证与质量控制n质量保证质量保证 quality assurance qu

2、ality assurancen 为使人们能确信某个产品为使人们能确信某个产品( (这里只培这里只培育基育基) )能满足规定的质量要求所必需执行能满足规定的质量要求所必需执行的有方案的和系统的活动的有方案的和系统的活动n提出质量要求并制定系统的质量控制方提出质量要求并制定系统的质量控制方案案n质量控制质量控制 quality control quality control n 为到达质量要求所采取的操作技术和为到达质量要求所采取的操作技术和活动活动n为到达质量要求所采取的详细的技术操为到达质量要求所采取的详细的技术操作作培育基制备指南：SN/T1538nSN/T1538.1-2019(2019

3、年7月1日实施)n第1部分:实验室培育基制备质量保证通那么n提出要求并制定系统的控制方案n属于质量保证的范围nSN/T1538.2-2019(待发布)n第2部分:培育基性能测试适用指南n为保证提出的质量要求所需求采取的技术操作n属于质量控制的内容规范制定情况简介nSN/T1538.1修正采用了ISO/TS11133-1：2000E(2000年6月1日发布)nSN/T1538.1修正采用了ISO/TS11133-2：2019E(2019年12月25日发布)本规范的作用nSN/T1538为培育基质量保证和质量控制规范体系，有利于对培育基的规范化管理，提高实验室检测质量：n第1部分为质量保证和培育基

4、质量根本要求n第2部分为质量控制技术n为CNAS合格评定的微生物实验室认证任务提供参考根据重点讲解内容n相关术语n主要质量保证要求n质量控制方法n质控菌株培育基n液体、半固体或固体方式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁衍或坚持其活力的物质培育基类型n各别成分培育基各别成分培育基 Culture medium prepared Culture medium prepared from individual components from individual components n实验室用不同的化学和实验室用不同的化学和/ /或生物试剂按照一定或生物试剂按照一定的配方、比例配置而成的培育基

5、的配方、比例配置而成的培育基n即用型培育基即用型培育基 ready-to-use medium ready-to-use medium n以即用方式置于容器中以即用方式置于容器中( ( 例如：平皿、试管或例如：平皿、试管或其它容器其它容器) ) 供应的培育基。供应的培育基。n脱水合成培育基脱水合成培育基 culture medium prepared culture medium prepared from commercially dehydrated formulation. from commercially dehydrated formulation. n不立刻便用的干粉方式的不立刻

6、便用的干粉方式的( (如：粉末、小颗粒、如：粉末、小颗粒、冻干等方式冻干等方式) )培育基。培育基。规范的主要内容n购置验收要求(CNAS-CL01 ：4.6.2)n消费企业提供资料n实验室外观检查记录n储存、运用、弃置要求CL11：5.9)n废品的质量控制(概述第2部分.重点为菌株)n物理目的:培育基外观n微生物目的:重点提到对测试菌株的要求nSN/T1538.1n常规质量控制要求n物理目的:外观控制n微生物目的:污染;生长率;选择性;特异性(CNAS-CL01 : 4.6.2; CNAS/CL11：5.9)n性能测试方法举例n对质量控制要求的补充阐明和详细实例nSN/T1538.2购置验收

7、要求n消费企业提供资料：n产品标签：n产品称号、编号n批号n运用前的pHn必要的平安/危害数据 n有效期n技术数据清单n质控证书n性能评价n所用测试菌株n实验室验收：n产品标签：n称号和批号n有效期n接纳日期n包装及其完好性nSN/T1538.1-2019中4.1;对应CNAS/CL01 4.6.2内容,通常要记录(采购效力和供应)储存要求n例行常规检查内容:n容器密闭性复查n初次开封日期n内容物的感官检查 n运用前检查(即用型培育基):n颜色能否发生变化?n能否蒸发/脱水?n能否有微生物生长 ?n注:SN/T1538.1:2019中4.2;对应CNAS/CL01:4.6.2内容,可不做记录实

8、验室自制和运用要求n培育基用水n称量和复水n溶解和分装npH测定n灭菌n监测n琼脂培育基融化n培育基脱气n添加成分制备和参与n平板的制备和储存n培育n注:SN/T1538.1-2019中4.3-4.4内容,对应CNAS/CL11:5.9部分内容,红色部分通常需做记录培育基的弃置要求n一切污染和未运用的培育基的弃置必需采用平安的方式，并且要符合相关法律法规的规定。n注:SN/T1538.1-2019中4.5内容,应符合CNAS/CL01:5.3.5(废弃物处置程序)要求质量控制根本要求n对培育基的要求n分装数量n外观、色泽和均一性n琼脂凝胶的硬度n水份含量npH n缓冲才干n微生物污染(即用培育

9、基)n对根底成分的要求n对不稳定的生物成分，运用时可根据情况调整用量。注:SN/T1538.2中对制造商的要求微生物学要求n微生物污染n生长特性n生长率n选择性n生理生化特性n选择性和特异性n抗菌实验特性n 红色部分为对培育基进展质量控制的主要内容生长率(定量测试方法)nPR = NS/NOnNS ：待测培育基平板上得到的菌落总数。nN0 ：参考培育基平板上获得的菌落总数，应100cfu n 要求：非选择性培育基上目的菌的生长率最低应为0.7，该类培育基应易于目的菌生长；选择性培育基上目的菌的生长率最低应为0.1n 选择性(定量测试方法)nSF = DO DSnD0：能在参考培育基上生长至少1

10、0个菌落的最高稀释度nDS：能在测试培育基上显示生长的最高稀释度 n非目的菌在选择性培育基上的SF至少为2 n半定量和定量法中，非目的菌应部分或全部被抑制 培育基测试方法n定量测试方法n半定量测试方法n定性测试方法几种方法的运用原那么n通常运用半定量或定性测试方法就能满足实验室对培育基性能测试的要求n评价新的培育基或新的供应商的产品时，应采用定量测试方法n采用定量方法时，必需运用参考培育基进展对照；采用半定量和定性方法时，运用参考有助于结果解释。n参考培育基必需是从近期批次中选出的知质量良好的培育基。引见几种常用的质控方法nMiles-Misra法(定量方法)n改良的平板划线法(半定量方法)n

11、平板接种察看法(定性方法)n上述均为固体培育基测试方法,液体培育基定量和半定量测试方法也要经过固体培育基菌落计数技术才干得到结果。改良Miles-Misra法操作方法n测试菌株过夜培育物10倍稀释n测试平板和参照平板划分为4个区域并标志n从最高稀释度开场 ，分别滴一滴稀释液于实验平板和对照平板标志好的区域n将稀释液涂满整个1/4区域，37C培育18 hr。n对易计数的区域计数，按公式计算结果方法举例测试培育基在10-5稀释度上有30个菌落参照培育基在10-5稀释度上有40个菌落经过公式计算： PR = 10-5 30/ 10-5 40=0.75注：在几种固体计数方法中，Miles-misra方

12、法和螺旋平板涂布法效果较好。改良的划线法接种法方式图计 算n计算生长指数G ：n每条有菌落生长的划线记作1分，每个n仅一半的线有菌落生长记作0.5分n没有菌落生长或生长量少于划线的一半，那么记作0n如：菌落在A区和B区全部生长，而在C区有一半线生长那么G 为10 目的菌在培育基上应呈现典型的生长，而非目的菌的生长应部分或完全被抑制 目的菌的生长目的G大于6时，培育基可接受结果解释定性测试方法 n用3mm接种环取测试菌培育物，在测试培育基外表划平行直线。可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉n按规范中规定的培育时间和温度对接种后的平板进展培育 结果解释n培育后按以下方法计分：n0表示无生

13、长n1表示微弱生长n2表示生长良好n目的菌得分应为2，并有典型的菌落外观、大小和形状n非目的菌的生长应部分或全部被抑制 质控菌株要求n规范菌株：来自国际/国家菌种保藏中心(本规范要求为ATCC菌株)或经ISO9002认证的经销商提供的菌株(有资质)n制备贮藏菌株和任务菌株时一次制备多份，每株菌原那么上不能反复运用n通常任务菌株不能再传代，但处置得当可再次运用规范贮藏菌株(Reference stock)n规范菌株在实验室经过一次传代获得的一组完全一样的菌株n传代菌株该当完全具备规范菌株的一切性状n传代时要保证一定的量(减少传代次数)n每株菌株尽量防止多次运用n采用不同的保管方法保管期限不同n如

14、冻干法,液氮法,穿刺法,液体石蜡法,斜面保管法等(见后)菌种保藏方法n液氮保管法n低温保管法n液体石蜡保管法液氮保管法液氮保管法保管制备细胞悬液，甘油或二甲亚砜作维护剂分装无菌安瓿瓶，每管0.2ml预冻至-40控制温度下降速率为1min放入液氮生物储存罐中气相保管恢复直接浸入38水浴中解冻510min转接于适宜培育基内培育留意：大多数属种适于慢速冻结和快速解冻适用菌种适用菌种病毒支原体各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌蓝藻动物细胞 液体石蜡覆盖保管法n传代保管的变相方法n可以适当地延伸保管时间n优质石蜡121高压灭菌2小时，160枯燥箱中灭菌12小时，放冷备用n液体石蜡的深度以1cm左右 n保

15、管期通常6个月至一年适用菌种n霉菌、酵母菌、放线菌、部分细菌。如：大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等需氧性细菌n不能用于低温冷冻保管的微生物如孢子构成才干极差的丝状菌n不适于用菌种：固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、沙门氏菌，丝状菌中的毛霉、根霉菌等甘油低温保藏法n保藏方法：菌种悬浮在保藏方法：菌种悬浮在1010( (体积分数体积分数) )甘油蒸甘油蒸馏水中。置于低温馏水中。置于低温(-70)(-70)保藏。保藏。n本卷须知：所要保藏的菌种，最好先培育至对本卷须知：所要保藏的菌种，最好先培育至对数期；运用液体培育基时，可直接加到已灭过数期；运用液体培育基时，可直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在菌的甘