提取基因组DNA和PCR原理

1、一、基本原理一、基本原理两个总原则：两个总原则：1 1 保持核酸一级结构的完整性保持核酸一级结构的完整性2 2 去除其他杂质保证核酸的纯度去除其他杂质保证核酸的纯度: :去除与去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类等大分子。核酸结合的蛋白质、多糖和脂类等大分子。沉淀不需要的核酸分子。沉淀不需要的核酸分子。分离：分离：通过酶、有机溶剂、调节通过酶、有机溶剂、调节pHpH值、离心等值、离心等手段得到粗制品手段得到粗制品纯化：纯化：去除杂质，纯化目的核酸。去除杂质，纯化目的核酸。三个过程：三个过程： 破膜、分离、纯化破膜、分离、纯化在高盐状态下，在高盐状态下，DNADNA纯化树脂纯化树脂ULtraPur

2、eULtraPureTMTM专一性地吸附专一性地吸附DNA;DNA;在低盐或水溶液状态在低盐或水溶液状态下下,DNA,DNA被洗脱下来被洗脱下来PCR原理增色效应：增色效应： DNA变性后对变性后对260nm紫外光收紫外光收增加的现象。增加的现象。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复经缓慢冷却后即可复性，此过程称为性，此过程称为退火退火(annealing)。减色效应减色效应：变性变性DNA复性后复性后对对260nm紫外光紫外光吸收减少的现象吸收减少的现象。1. 常用的变性方法：常用的变性方法： 热变性热变性 酸碱变性酸碱变性 化学试剂变性化学试剂变性 Tm值的估算值的估算 20bp Tm

3、=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%） q热启动PCRqTouch-down PCRqRT-PCRq兼并引物PCRq巢氏PCRq反向PCRq不对称PCRq原位PCRq连接酶链反应qRACE-PCRqAFLPq免疫-PCR(immuno-PCR)qMSP甲基化特异PCR目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物引物和非限制性引物, ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01

4、0.5M,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段，片段，对某个已知对某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。12341234 利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记, , 用以直观地检测目的基因。用以直观

5、地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分 锚定锚定PCRPCR首先合成第一链首先合成第一链cDNA,cDNA,然后再添加一同然后再添加一同聚物尾（聚物尾（polydG),polydG),与同聚物尾配对的与同聚物尾配对的33锚定引物（锚定引物（带有限制性内切位点带有限制性内切位点polydC)polydC)一起作一起作PCRPCR扩增扩增可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由是由HaaseHa

6、ase等于等于19901990年首创。它是利用完整的细胞作为年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段, ,在不破在不破坏细胞的前提下坏细胞的前提下, ,利用一些特定的检测手段来检测细胞利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。中含量较少的靶序列。操作步骤操作步骤1. 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般适于一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2. PCR2. PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3. 3. 原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, ,对对PCRPCR产物进行标产物进行标 记跟踪记跟踪, ,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程, ,结结合相应的软件可以对结果进行分析合相应的