植物表达载体转化农杆菌操作步骤

1、植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源： 郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤 第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择： LBA4404、 EHA105、 GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB 培养基上画线（或加或不加抗生素， LBA4404:Rif或Str； EHA105: Rif或Str； GV3103:庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50卩g/ml。28C培养。3、农杆菌感受态细胞的制备:1） 挑取单菌落接种于 3ml LB液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养至 OD600 =0.5。2）吸取

2、 1.5ml 菌液于离心管中，冰浴 10min；3）5000 （13000） rpm离心30s,弃去上清液；4）沉淀用 1.5 ml 0.5M NaCl 悬浮,冰浴 20min；5）5000 （13000） rpm离心30s,弃去上清液；6）每管用100卩l 20mMCaCI2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4 C保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70C保存。使用时从一 70C取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接转化农杆菌：1） 50卩l农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.11卩g （ 5- 10ul）,之后冰浴30

3、 min ；2）放入液氮中5min （或1min）,然后立即放入 37C水浴锅中水浴 5min ；3） 取出离心管，加入 0.5mlLB, 28 C、220rpm振荡培养 35hr ；4） 取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28C条件下倒置培养。2天左右 菌落可见。（pEmu 载体：AMP+Rif/Str ； pK载体：Kan+ Rif/Str ； pTCK载体：Kan+ Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1） 挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28 C振荡培养过夜。（pEmu 载体：AMP+Rif/Str ； pK载体：Kan+ Rif/Str ； pTCK

4、载体：Kan+ Rif/Str）2） 小量提取质粒 DNA,加GTE同时加5卩L溶菌酶（50卩g "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或 10mg/ml ）。3）质粒酶切或PCR鉴定。6、三亲交配法：1） 接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37 C培养；（pEmu 载体：50 卩 g"ml -1AMP ； pK载体：50 卩 g"ml -1Kan ； pTCK载体：50 卩 g"ml -1Kan）2） 接种含动员质粒 pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37C培养；3） 接种受体农杆菌 EHA105/LBA4404于50卩g&q

5、uot;mL-1 Rif/Str的LB平板上28 C培养；4） 分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5） 待三种菌生长到对数期时，各取50卩L,混匀，涂布于无抗生素的LB平板上，28C培养过夜；6） 挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28 C振荡培养24h；(pEmu 载体：50 卩 g"ml -1AMP + 50 卩 g"mL-1 Rif/Str ； pK载体：50 卩 g"ml -1Kan+ 50 卩 g"mL-1Rif/Str; pTCK载体：50 卩 g"ml -1Kan + 50 卩 g&qu

6、ot;mL-1 Rif/Str)7） 用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28 C培养至长出单菌落；（pEmu 载体：50 卩 g"ml -1AMP + 50 卩 g"mL-1 Rif/Str; pK载体：50 卩 g"ml -1Kan+ 50 卩 g"mL-1Rif/Str; pTCK载体：50 卩 g"ml -1Kan + 50 卩 g"mL-1 Rif/Str）8） 随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。10）将阳性单菌落再次划线纯化。三亲交配法：1）从保存

7、根癌农杆菌 LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于 10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28C , 200rpm培养24h;2）从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml 不含抗生素的 LB液体培养基中，37 C, 250rpm培养约8h;3）从保存辅助质粒 pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于 10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37 C , 250rpm培养约8h;4）分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28 C培养过夜；5）用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml

8、和Rif 25ug/ml的LB平板上，28 C培养过夜；同时各取1,2, 3步骤中的菌液100u分别涂布于含有三种抗生素的LB平板上，作为对照。注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用PCR鉴定。（PCR鉴定时要做好阴性对照。一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌 做对照）。另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中,再提取质粒酶切鉴定。注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性1 ）、利福平, 溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容, 贮液 20

9、mg/ml , -20 保存三个月, 使用浓度 50100L。2 ）、禾U福平（Rif）先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。3） 、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml ,于20度保存。工作浓度 50ug/ml4） 、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml 后于 20度保存。工作浓度 50ug/ml5） 、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮 存。常以10ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。抗生素 储存液 工作浓度浓度（mg/ml） 保存条件严紧型质粒（卩g/ml） 松弛型质粒（卩g/ml）氨苄青

10、霉素50 （溶于水 ） -20C 20 60羧苄青霉素50 （溶于水 ） -20C 20 60氯霉素 34 （溶于乙醇 ）-20C 25170卡那霉素 10 （溶于水 ）-20C 10 50链霉素 10 （溶于水 ） -20C 10 50四环素 5 （溶于乙醇 ） -20C 10 507、水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮， 于70%酒精浸泡3mi n（或75%酒精浸泡1min ）, 再于0.1%升汞中浸泡15min （或再转入20%的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌 25min），超 净工作台中无菌水清洗 3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上

11、，每个皿约放35粒，28C暗培养4 5d,切除胚根，继续培养12-15d ,待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代 2-3 次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方 法消毒后，置于诱导培养基上。28C暗培养至长出愈伤组织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。 （第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）8、根癌农杆菌的培养平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50卩g"ml -1AMP+ 50 卩 g"mL-1 Rif/Str; pK载体：50 卩 g"ml -1Kan + 50 卩 g"mL

12、-1 Rif/Str ; pTCK载体：50 卩 g"ml -1Kan+ 50卩g"mL-1 Rif/Str） , 28 C摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含 相应抗生素）培养 8 小时左右至 OD600 为 0.5 左右。4 C, 5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬 浮沉淀，将菌液转入 50mL的含100uM AS的AAM液培中，28 C摇床上培养至 0D600=0.5。9、愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2 3mm 的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养

13、基，27C暗培养3 4天。生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养 4d 的水稻幼胚去掉胚芽或继代 2-3 周后 2-3mm 的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d） ，置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM 农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于 无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28C（或25C）暗培养 2 3 天。11、洗除农杆菌共培养 2 3 天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌 三角瓶中，用（含有 250mg

14、"L-1 羧苄青霉素的）无菌水冲洗 3-5 次，每次摇动数次，直至水 中看不到丝状菌体。 最后一次清洗时静止 1 小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水， 静止30 50min，期间振荡几次，倒掉液体,25 C培养箱内暗培养。1 次。培养 4 8 周，多数愈伤褐化 挑选这些抗性愈伤继续在选择培养置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置11、抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接 死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。基上暗培养 2 次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。（并转入筛

15、选培养基 N6-S1 中，进行选择培养。 两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织， 转到N6-S2筛选培养基上继续筛选 2-3代，2周/代）。（N6 -S1： N6， 100mg"L-1G418， 250mg"L-1 羧苄青霉素）（N6 -S2： N6， 50mg"L-1G418，125mg"L-1 羧苄青霉素）12、抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26 C暗培养1周，然后转入25 C光照培养（12h光照，12h黑暗）。13、转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养 2 周后愈

16、伤开始转绿， 3 周后即可长出幼芽，随之 根也长出。（筛选 4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进 行分化出苗，光照 24h/d ，再生的小苗长至 2-3cm 左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小 三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高 710cm 时，打开瓶盖于温室中炼苗 57 天， 待小苗生长健壮后， 移出培养瓶， 洗净跟上的培养基， 移至温室盆栽 （铁盘中）。注意保湿， 以提高移栽成活率。筛选剂类型：在植物基因转化中， 外源基因稳定整合的频率低。 如何选择适当的筛选标记以准确、 有效地 区分转化与非转化细胞， 产生选择压力， 使未转化细胞不能生长， 且不干扰细

17、胞的正常生长 与植株再生是转化成功的重要环节之一。1、 较早应用于水稻转化实验的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因（NPTH ），对卡那霉素具有抗性。但由于水稻对卡那霉素具有天然抗性，没能广泛应用。G418 是一种与卡那霉素饵近的氨基糖苷类抗生素， 不能被新霉素磷酸转移酶激活， 用它作选择标记比卡那霉素更 有效，而且再生绿苗频率更高。2、 现在 bar 当作选择基因也已被用于水稻遗传转化研究（Bar 基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂 PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。）。3、潮霉素磷酸转移酶（HPTH ）基因是另一应用广泛且更有效的标记基因，它具有对潮霉素的

18、抗性，用潮霉素可以明显区分已转化和未转化的组织。 不同选择剂应用浓度和选择时间应根 据不同材料的具体情况而定。 马炳田等报道了通过调节潮霉素的使用浓度， 在抗虫转基因水 稻研究中提高筛选率，结果表明：筛选时潮霉素使用浓度为2030 mg/L;分化时潮霉素使用1525 mg/L,可得到较高的抗性愈伤组织筛选率和绿苗分化率。总结分析：1、pEmumcsN 载体：载体带有 Amp 抗性基因，在大肠杆菌和农杆菌中可用 Amp 作抗性筛选。但是载体自身不带有 NPT11或HPT基因，所以转基因植株不能用 G418或者潮霉素 来筛选。 且载体不带有报告基因， 因此不能用报告基因来筛选阳性植株。 只能通过与带有抗 性基因和报告基因的载体进行双质粒共转化来转化植株，才能用G418 或者潮霉素和诸如GUS等报告基因筛选阳性克隆株。2、 pKYLX71:35S2载体：载体带有 Tet和Kan抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因NPTH。在大肠杆菌和农杆菌中可用 Kan和Tet来作抗性筛选，在转基因愈伤组织中可用G418来抗性筛选转化和未转化的组织。但是不确定改载体是否带有GUS报告基因，因此也不确定转基因植株是否可以用 GUS 报告基因来筛选。3、 pTCK303载体：载体带有Kan抗性基因、潮霉素磷酸转移酶（HPTH ）基因、GUS报告基因。 在大肠杆菌和农杆菌中可用Kan来作抗性筛选