分子生物学课件第五章：基因表达调控真核生物

1、 第五章第五章 基因表达的调控基因表达的调控 主讲教师:刘 静 中南大学生物科学与技术学院中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心分子生物学研究中心 多细胞真核生物多细胞真核生物，遗传信息从细胞，遗传信息从细胞核的基因组核的基因组DNA传递到基因编码的蛋白传递到基因编码的蛋白质均受到多层次的调控。质均受到多层次的调控。第二节第二节 真核生物基因表达的调控真核生物基因表达的调控 一、真核生物基因表达的特点一、真核生物基因表达的特点 1.1.细胞具有全能性细胞具有全能性 全能性：全能性：指同一种生物指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组的所有细胞都含有相同的基因组DNADNA，都有，都有发育

2、成完整个体的潜能。发育成完整个体的潜能。 2.2.基因表达的时间性和空间性基因表达的时间性和空间性 时间性：时间性：个个体发育的不同阶段，基因表达的种类和数体发育的不同阶段，基因表达的种类和数量是不同的；量是不同的；空间性：空间性：在不同组织和器官在不同组织和器官中，基因表达的种类和数量是不同的。中，基因表达的种类和数量是不同的。13.3.转录和翻译分开进行转录和翻译分开进行 真核生物真核生物DNADNA在核在核中转录生成中转录生成 mRNAmRNA，穿过核膜至胞质指导蛋，穿过核膜至胞质指导蛋白质合成；转录和翻译不是同步进行的，受白质合成；转录和翻译不是同步进行的，受多层次调控。多层次调控。

3、4.4.初级转录产物要经过转录后加工修饰初级转录产物要经过转录后加工修饰 初级转录产物为核不均一初级转录产物为核不均一RNA RNA （heterogeneous nuclear RNA , hnRNAheterogeneous nuclear RNA , hnRNA）5.5.不存在超基因式操纵子结构不存在超基因式操纵子结构 真核生物基因真核生物基因转录产物为单顺反子。转录产物为单顺反子。6.6.部分基因多拷贝部分基因多拷贝 某些基因以多拷贝形式某些基因以多拷贝形式存在，如组蛋白和存在，如组蛋白和 tRNAtRNA等，这样既可满足细等，这样既可满足细胞的需要，也是表达调控的一种有效方式。胞的需

4、要，也是表达调控的一种有效方式。单顺反子(monocistron) 编码编码一个一个多肽链的多肽链的DNADNA的序列的序列区域，相当于真核细胞的一个基因。区域，相当于真核细胞的一个基因。translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene35单顺反子单顺反子mRNA (monocistronic mRNA) （一）基因组（一）基因组DNA水平的调控水平的调控 1.染色质的丢失染色质的丢失 不可逆的调控。不可逆的调控。 线虫线虫 胚胎期：胚胎期：1090个细胞个细胞 成成 虫：虫：959个细胞个细胞 131个细胞在发育过程中发生凋亡个细胞在发育过

5、程中发生凋亡 二、二、真核生物基因表达的调控机制真核生物基因表达的调控机制 2. 基因扩增（基因扩增（gene amplification） 当细胞对某种基因产物需要量剧增，当细胞对某种基因产物需要量剧增，单纯靠调节其表达活性不足满足需要，只单纯靠调节其表达活性不足满足需要，只有增加这种基因的拷贝数。有增加这种基因的拷贝数。 不适当的基因扩增可导致某些疾病的不适当的基因扩增可导致某些疾病的发生。发生。3.基因重排（gene rearrangement）VJ C V JCVJ C 免疫球蛋白免疫球蛋白IgGIgG基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白分子的多样性奠定

6、了基础分子的多样性奠定了基础 指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。BCR-ABL融合基因形成示意图融合基因形成示意图(140 kDa)(160 kDa)4.4.基因的甲基化修饰基因的甲基化修饰 DNA上特定的上特定的CpG序列处的胞嘧啶发生甲基序列处的胞嘧啶发生甲基化修饰（化修饰（5mC）。甲基化程度与基因的表达一般）。甲基化程度与基因的表达一般呈反比关系。甲基化程度愈高，基因的表达则降呈反比关系。甲基化程度愈高，基因的表达则降低。去甲基化，基因的表达

7、增加。低。去甲基化，基因的表达增加。GCGCGCGCGene DNA DNA 甲基化甲基化研究研究分析分析方法方法原理：原理：甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的转录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基转录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基因转录活性。因转录活性。方法：方法：选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基化敏感性内切酶对待测序列进行酶切。化敏感性内切酶对待测序列进行酶切。应用：应用：分析抑瘤基因表达下调的机制；分析抑瘤基因表达下调的机制； 分析组织分析组织/ /发育阶段特异性基因的表达机制。发育阶段

8、特异性基因的表达机制。 5.染色质结构对基因表达的调控作用 组蛋白与组蛋白与DNA结合与解离是真核基因表达调结合与解离是真核基因表达调控的重要机制之一。控的重要机制之一。 非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。 常染色质中疏松状态的活性染色质是基因转常染色质中疏松状态的活性染色质是基因转录前在染色质水平上独特的调控机制。录前在染色质水平上独特的调控机制。1.转录起始复合物的形成转录起始复合物的形成2.顺式作用元件顺式作用元件 (cis-acting element)3.反式作用因子反式作用因子 (trans-acting factor)4.转录水平

9、的调控机制转录水平的调控机制 （二）真核生物基因转录调控（二）真核生物基因转录调控 以以RNA聚合酶聚合酶为例为例1.1.转录起始复合物的形成转录起始复合物的形成 转录起始前复合物转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)和和转录起始复合物转录起始复合物(transcription initiation complex, TIC)的形成。的形成。 真核生物真核生物RNA pol不与不与DNA直接结合，直接结合，而需要依靠众多的转录因子。而需要依靠众多的转录因子。 2. 顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element) 指某些能影响基因表达但不编码

10、新的指某些能影响基因表达但不编码新的蛋白质和蛋白质和RNA的的DNA序列序列，按照功能分为，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件（沉默子等）。启动子、增强子、负调控元件（沉默子等）。 （ 1）启动子）启动子(promoter) 在基因转录起始位点在基因转录起始位点(+1)及其及其5上游上游近端大约近端大约100200 bp 以内的一组具有独以内的一组具有独立功能的立功能的DNA序列。每个元件长度约为序列。每个元件长度约为720 bp，是决定，是决定RNA聚合酶聚合酶转录起始点和转录起始点和转录频率的关键元件。转录频率的关键元件。 真核类基因的顺式作用元件图 核心启动子核心启动子(core p

11、romoter) 包括包括“转录起始位点转录起始位点”及其上及其上游游-25-30 bp 处富含处富含TA的典型元件的典型元件“TATA”盒。核心序列为盒。核心序列为TATAAAA，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。 上游启动子元件上游启动子元件( upstream promoter element, UPE)包括通常位于包括通常位于-70 bp 附近的附近的CAAT盒盒(CCAAT)和和GC盒盒(GGGCGG），功能：调节转录起始的频率，提高转录效率。），功能：调节转录起始的频率，提高转录效率。 （2） 增强子增强子(enhancer)

12、 位于启动子上游或下游并通过启位于启动子上游或下游并通过启动子增强邻近基因转录效率的动子增强邻近基因转录效率的DNA顺顺序，增强子本身不具备启动子活性。序，增强子本身不具备启动子活性。 (3) 其他元件其他元件 包括负调控元件和终止子等。包括负调控元件和终止子等。 负调控元件负调控元件: 沉默子（沉默子（silencer） 或衰减或衰减子（子（dehancer） 真核基因内能抑制基因转录的真核基因内能抑制基因转录的DNA序序列，与反式作用因子相互结合而起作用。列，与反式作用因子相互结合而起作用。不受距离和方向的限制，并可对异源基因不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。的表达起作用。

13、终止子终止子 在模板在模板DNA分子的分子的5端转录终止信号。端转录终止信号。通常具有通常具有po1yA尾的基因终止信号为尾的基因终止信号为GT簇，例如在簇，例如在SV40中的中的AGGTTTTTT序列为序列为终止转录调控元件。终止转录调控元件。 3.3.反式作用因子反式作用因子( (trans-acting factor) ) 能直接或间接地识别或结合在各顺能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件式作用元件812bp核心序列上，参与核心序列上，参与调控靶基因转录效率的调控靶基因转录效率的一组蛋白质一组蛋白质。 在结构上含有与在结构上含有与DNA结合的结构域。结合的结构域。（1）反式作用因子根

14、据作用方式分为三类：）反式作用因子根据作用方式分为三类： 通用转录因子。通用转录因子。普遍存在的转录因子。如普遍存在的转录因子。如TATA box结合因子结合因子 TFD、GC box结合因子结合因子SP1 等。等。组织特异性转录因子。组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性与基因表达的组织特异性有很大关系。有很大关系。诱导性反式作用因子。诱导性反式作用因子。活性能被特异的诱导因子活性能被特异的诱导因子所诱导。所诱导。（2 2）转录因子）转录因子( (transcription factor，TF ) ) RNA合成起始所必需的因子。合成起始所必需的因子。TF不依赖不依赖RNA聚合酶而独立地

15、结合聚合酶而独立地结合DNA，在转录过程，在转录过程中促使许多中促使许多RNA聚合酶分子与启动子结合。聚合酶分子与启动子结合。 (2) 转录因子结构转录因子结构DNA结合域转录活化域TF结合其它蛋白质结构域（如，二聚化结构域） TFA结构域示意图结构域示意图TFA肽链的指结构肽链的指结构域含有域含有9个指，与相个指，与相应的应的DNA序列结合，序列结合，指指“尖尖”可以进入可以进入DNA双螺旋的大沟或双螺旋的大沟或小沟。但羧基端不具小沟。但羧基端不具有指结构，是有指结构，是RNA聚聚合酶合酶和其它的转录和其它的转录因子相互作用的部位。因子相互作用的部位。 TATA因子与因子与TATA盒结合，盒

16、结合，形成稳定的转录复合物，介导形成稳定的转录复合物，介导RNA聚合酶聚合酶分子转录。分子转录。 真核基因开放的转录起始复合物的形成图真核基因开放的转录起始复合物的形成图 RNA聚合酶聚合酶识别并结合以识别并结合以上蛋白质上蛋白质-DNA复合物。形成复合物。形成闭合复合物，闭合复合物，DNA双链没有打双链没有打开，不能启动转录。开，不能启动转录。 转录起始因子与转录起始因子与RNA聚合酶聚合酶结合，使结合，使DNA部分双螺旋解开部分双螺旋解开成为开放的转录起始复合物，成为开放的转录起始复合物，转录开始合成转录开始合成RNA。DNADNA识别结合域：识别结合域： 锌指（锌指（zinc finge

17、r）结构）结构 ACys2His2锌指结构； B折叠的Cys2His2锌指结构；CCys2Cys2锌指结构同源结构域（同源结构域（homeodomain，HD） 同源盒基因家族各基同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序因间具有一相同的保守序列。所含的至少二个列。所含的至少二个螺旋螺旋中形成中形成“转折转折”，第三个，第三个螺旋与螺旋与DNA大沟相互作用，大沟相互作用，是同源盒蛋白与是同源盒蛋白与DNA结合结合的主要力量的主要力量 。碱性碱性-亮氨酸拉链亮氨酸拉链亮氨酸之间相互作用亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成形成二聚体，形成“拉链拉链” ” 。肽链氨基端肽链氨基端20203030个个富含

18、碱性氨基酸结构富含碱性氨基酸结构域与域与DNADNA结合。结合。DNA结合部位结构域结合部位结构域疏水性疏水性亲水性亲水性亲水性亲水性螺旋螺旋-环环-螺旋（螺旋（helix-loop-helix，HLH） 含两个双性含两个双性-螺旋，每螺旋，每34个氨基酸含一个个氨基酸含一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。能阻断螺旋的氨基酸残基。酸性酸性-螺旋（螺旋（acidic -helix domain） 能非特异能非特异性地与起始复合物（如性地与起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用盒结合因子）相互作用发挥转录活化功能。

19、发挥转录活化功能。富含谷氨酰胺的结构域（富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-rich domain） 最强的转录活化域之一。最强的转录活化域之一。富含脯氨酸结构域（富含脯氨酸结构域（proline-rich domain） 2)转录活化结构域转录活化结构域 （transcriptional activation domain）3.3.转录水平的调控机制转录水平的调控机制()反式作用因子的活性调节反式作用因子的活性调节 真核基因转录起始的调节，首先表现真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因

20、式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。的转录。反式作用因子的激活方式反式作用因子的激活方式: :表达式调节表达式调节共价修饰共价修饰 A.磷酸化去磷酸化。磷酸化去磷酸化。 B.糖基化。糖基化。配体结合配体结合 ：(核受体超家族核受体超家族)蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质相互作用（2）反式作用因子作用方式）反式作用因子作用方式 1）成环（）成环（looping）2）扭曲）扭曲(twisting)3）滑动）滑动(sliding)4）Oozing 反式作用因子与顺式元件结合如何影响到反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距离远距离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？聚合酶结合并影响其调控基

21、因？ （3）反式作用因子的组合式调控基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。1（1 1）报道基因分析法原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质粒中质粒中, ,再转染细胞再转染细胞, ,通过报道基因的活性可检通过报道基因的活性可检测转录活性。测转录活性。应用：启动子活性的检测应用：启动子活性的检测常用的报道基因：常用的报道基因：Luciferase Luciferase （荧光素酶）、（荧光素酶）、 GFPGFP（绿色荧光蛋白）（绿色荧光蛋白）、 SEAPSEAP（分泌性碱性磷酸酶）（分泌性碱性磷酸酶）4.4.转录水平

22、研究方法转录水平研究方法1（2 2）DNaseDNase超敏感分析法超敏感分析法原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经DNaseDNase消化常出现长短不均一的消化常出现长短不均一的100100200 bp 200 bp 的的DNADNA片片段，说明此段，说明此 DNA DNA 受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseDNase高敏感点高敏感点(hypersensitive site)(hypersensitive site)。方法：用方法：用 DNaseDNase处理细胞核处理细胞核DNADNA，再用合适

23、的内切酶进，再用合适的内切酶进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行southern southern 杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。1（3 3）足纹法（）足纹法（foot printing)foot printing)原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻止核酸酶对其的降解。方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用DNase进行切割，电泳，分析图谱。应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。1（4 4）凝胶迁移率凝胶迁移率（gel sh

24、ift assay) 或或电泳迁移率实验电泳迁移率实验（EMSA） 原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率会发生改变， DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射自显影。 应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。(三三)转录后水平的调控转录后水平的调控1. 5端加帽和端加帽和3端多聚腺苷酸化及意义端多聚腺苷酸化及意义 5端加帽端加帽:真核生物转录生成的真核生物转录生成的mRNA在转录后，在转录后，在在5端加上端加上7甲基鸟苷甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)

25、。 意义意义:保护转录体保护转录体mRNA不受不受5外切酶降解，外切酶降解，增强增强mRNA稳定性，有利于稳定性，有利于mRNA从细胞核向胞从细胞核向胞质转运，促进质转运，促进mRNA与核糖体结合（通过帽结合与核糖体结合（通过帽结合蛋白介导完成）。蛋白介导完成）。 3端加尾端加尾:转录后在转录后在mRNA在在3末端加上末端加上50150个腺苷酸，即个腺苷酸，即poly(A)尾尾。意义意义:保证保证mRNA在转录过程中不被降解。在转录过程中不被降解。2. mRNA前体的选择性剪接前体的选择性剪接(alternative splicing)对基因表达的调控作用对基因表达的调控作用 （1）mRNA前体的剪接前体的剪接 真核细胞基因表真核细胞基因表达所转录出的达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下，前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的形成成熟的mRNA，这一过程即为剪接。，这一过程即为剪接。 高等真核细胞中，某个内含子高等真核细胞中，某个内含子5的供点的供点在特定条件下可与另一个内含子在特定条件下可与另一个内含子3受点进行受点进行剪接，同时删除这两个内含子及其中间的全部剪接，同时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含