第五中药制剂分析生物碱

1、第五章第五章 中药制剂中各类化学成分分析中药制剂中各类化学成分分析 第一节第一节 含生物碱（含生物碱（alkaloid）类成分的分析）类成分的分析一、概述一、概述广义上是指生物界所有含广义上是指生物界所有含N的碱性天然的碱性天然有机物，大多具有复杂的环状结构，氮有机物，大多具有复杂的环状结构，氮原子多在环内，多数具有光学活性，有原子多在环内，多数具有光学活性，有特殊而较显著的生理活性。特殊而较显著的生理活性。 生物碱的分布生物碱的分布 生物碱是中药中重要的有效成分之一，至少有生物碱是中药中重要的有效成分之一，至少有50多科，多科，120属以上植物中有生物碱存在，以属以上植物中有生物碱存在，以双

2、子叶植物最多，其次是单子叶植物、裸子植双子叶植物最多，其次是单子叶植物、裸子植物。物。含生物碱量多的科有罂粟科、防已科、茄科、含生物碱量多的科有罂粟科、防已科、茄科、小檗科、毛茛科、芸香科、夹竹桃科、马钱科小檗科、毛茛科、芸香科、夹竹桃科、马钱科及茜草科等，及茜草科等，中药有三尖杉、麻黄、黄连、黄中药有三尖杉、麻黄、黄连、黄柏、乌头、延胡索、粉防已、颠茄、洋金花、柏、乌头、延胡索、粉防已、颠茄、洋金花、贝母、百部等。贝母、百部等。物理性质物理性质二、生物碱的理化性质二、生物碱的理化性质溶解度溶解度多数极性较小，属于亲脂性碱，游离状态下多数极性较小，属于亲脂性碱，游离状态下几乎不溶于水。成盐后则

3、水溶性增加，易溶几乎不溶于水。成盐后则水溶性增加，易溶于水及醇中于水及醇中，不溶或难溶于苯、氯仿、乙醚不溶或难溶于苯、氯仿、乙醚等。等。生物碱和其盐这一相反的溶解性质可以生物碱和其盐这一相反的溶解性质可以用于它的提取、分离和精制。用于它的提取、分离和精制。个别生物碱溶解性能较特殊，如麻黄碱既溶个别生物碱溶解性能较特殊，如麻黄碱既溶于水又可溶于有机溶剂；另小檗碱盐酸盐难于水又可溶于有机溶剂；另小檗碱盐酸盐难溶于水，但硫酸盐溶解度增加溶于水，但硫酸盐溶解度增加10倍。季胺碱、倍。季胺碱、酰胺型碱和一些含极性基团较多的游离生物酰胺型碱和一些含极性基团较多的游离生物碱则能溶于水。碱则能溶于水。酸碱性酸

4、碱性生物碱结构中含氮，多呈碱性。能与无生物碱结构中含氮，多呈碱性。能与无机酸、有机酸成盐机酸、有机酸成盐N： + H+X- N：H+X-碱性强弱为：季胺碱性强弱为：季胺 叔胺叔胺 仲胺仲胺 伯胺伯胺 酰胺酰胺沉淀反应沉淀反应三、含生物碱类成分中药制剂的定性鉴别三、含生物碱类成分中药制剂的定性鉴别（一）生物碱样品的制备（一）生物碱样品的制备常用的提取溶剂系统常用的提取溶剂系统 非极性溶剂系统：一般先用非极性溶剂系统：一般先用10%的氢氧的氢氧化铵、碳酸氢钠或氢氧化钠碱化，使生物化铵、碳酸氢钠或氢氧化钠碱化，使生物盐游离，后用氯仿或乙醚提取，缺点是不盐游离，后用氯仿或乙醚提取，缺点是不能提出水溶性

5、生物碱。能提出水溶性生物碱。极性溶剂系统：极性较大的生物碱可用极性溶剂系统：极性较大的生物碱可用中性甲醇、乙醇、酸水（常用中性甲醇、乙醇、酸水（常用0.1%-1%的盐酸、硫酸等）以及缓冲液提取，的盐酸、硫酸等）以及缓冲液提取，但提出的杂质较多，需净化。但提出的杂质较多，需净化。 （一）一般理化鉴别（一）一般理化鉴别（二）色谱鉴别（二）色谱鉴别1、薄层色谱法、薄层色谱法吸附剂的选择吸附剂的选择：硅胶本身有弱酸性，与生物碱：硅胶本身有弱酸性，与生物碱成盐，使吸附力增强，若用中性展开系统，其成盐，使吸附力增强，若用中性展开系统，其Rf值小，易拖尾。值小，易拖尾。一般用碱性展开系统或在一般用碱性展开系

6、统或在中性中加少量碱性溶剂，如二乙胺、氢氧化铵中性中加少量碱性溶剂，如二乙胺、氢氧化铵或用氨水饱和（展开缸中放一小杯氨水）或制或用氨水饱和（展开缸中放一小杯氨水）或制备碱板（在硅胶板中加稀碱溶液）备碱板（在硅胶板中加稀碱溶液）。碱性氧化碱性氧化铝因本身带有碱性，故用中性展开剂即可使生铝因本身带有碱性，故用中性展开剂即可使生物碱得到很好的分离。物碱得到很好的分离。脂溶性生物碱脂溶性生物碱-用吸附薄层法，用活度较用吸附薄层法，用活度较大的吸附剂如硅胶、氧化铝。大的吸附剂如硅胶、氧化铝。水溶性生物碱水溶性生物碱-用硅藻土、纤维素作为支用硅藻土、纤维素作为支持剂，硅胶板也可以持剂，硅胶板也可以展开剂的

7、选择展开剂的选择脂溶性生物碱采取极性小的溶剂脂溶性生物碱采取极性小的溶剂水溶性用极性大的溶剂水溶性用极性大的溶剂但一般用混合溶剂较多，单一溶剂少但一般用混合溶剂较多，单一溶剂少显色剂的选择显色剂的选择某些生物碱本身有颜色，可直接于可见光某些生物碱本身有颜色，可直接于可见光下观察。下观察。有紫外吸收的可用紫外检测。有紫外吸收的可用紫外检测。但大部分生物碱无色且无荧光，则需喷显但大部分生物碱无色且无荧光，则需喷显色剂，色剂，最常用的显色剂有改良碘化铋钾、最常用的显色剂有改良碘化铋钾、碘蒸气、氨蒸气碘蒸气、氨蒸气2、纸色谱法、纸色谱法游离生物碱游离生物碱甲酰胺为固定相，固定相饱和的甲酰胺为固定相，固

8、定相饱和的有机溶剂为展开剂。有机溶剂为展开剂。 生物碱盐生物碱盐滤纸中的水为固定相，滤纸中的水为固定相，BAW系统系统为展开剂。为展开剂。 3、高效液相色谱法、高效液相色谱法4、气相色谱法、气相色谱法 四、含生物碱类成分中药制剂的含量测定四、含生物碱类成分中药制剂的含量测定（一）总生物碱的含量测定（一）总生物碱的含量测定1、化学分析法、化学分析法（1）酸碱滴定法是利用生物碱含有N原子具有碱性，可用酸滴定。对于不溶于水的游离生物碱一般常溶于过量标准酸液中，再用标准碱回滴对于游离生物碱能溶于水或水-醇溶液中的可直接滴定（2）双相滴定法指的是水相和有机相是在水及与水不相混溶的有机溶剂中进行滴定，被滴

9、定的待测成分先溶于水相（或有机相）中，一般是水相。滴定时，产生的滴定产物不断进入有机溶剂中，当滴定过量时，指示剂即在水相（或有机相）产生颜色变化，或滴定剂本身产生颜色变化指示终点。（3）重量法重量法 多为测定总生物碱的含量，据游离生物碱和多为测定总生物碱的含量，据游离生物碱和生物碱盐在水和水不相溶的有机溶剂中的溶生物碱盐在水和水不相溶的有机溶剂中的溶解度不同而设计的；或利用与沉淀试剂反应解度不同而设计的；或利用与沉淀试剂反应形成不溶性盐来设计形成不溶性盐来设计(1) 提取重量法提取重量法(2) 形成不溶性盐的重量法形成不溶性盐的重量法2、 分光光度法分光光度法用于测定中药制剂中总生物碱的含量，

10、一些生用于测定中药制剂中总生物碱的含量，一些生物碱具有特殊的结构，本身具有颜色、或与氧物碱具有特殊的结构，本身具有颜色、或与氧化剂产生颜色，或因所具有的官能团与试剂反化剂产生颜色，或因所具有的官能团与试剂反应产生颜色。如利用其通性与雷氏盐、苦味酸应产生颜色。如利用其通性与雷氏盐、苦味酸产生有色化合物，在一定的波长条件下进行比产生有色化合物，在一定的波长条件下进行比色测定。色测定。（1）直接测定法）直接测定法（2）离子对萃取比色法）离子对萃取比色法酸性染料比色法酸性染料比色法在一定在一定pH介质中，生物碱介质中，生物碱B可与氢离子可与氢离子H+结结合生成生物碱盐的阳离子合生成生物碱盐的阳离子BH

11、+，而酸性染料，而酸性染料在此条件下解离为阴离子在此条件下解离为阴离子In-, ,则阴阳离子能则阴阳离子能定量定量结合生成有色化合物（离子对）。结合生成有色化合物（离子对）。再用合适的有机溶剂将该离子对提取，测定再用合适的有机溶剂将该离子对提取，测定其吸收度值，进而对生物碱定量。其吸收度值，进而对生物碱定量。注意事项注意事项：1、选择适当的选择适当的pH 则生物碱成盐，则生物碱成盐，成为阳离子成为阳离子BH+而酸性染料成为阴离子而酸性染料成为阴离子In-，阴阳，阴阳离子可结合。如离子可结合。如pH太低，则水相酸性强，虽然生太低，则水相酸性强，虽然生物碱成盐，但酸性染料亦以酸的形式存在；物碱成盐

12、，但酸性染料亦以酸的形式存在；pH太太高则水相碱性强，生物碱以游离状态存在，酸性染高则水相碱性强，生物碱以游离状态存在，酸性染料以离子形式存在。都不能使阴阳离子定量地结合。料以离子形式存在。都不能使阴阳离子定量地结合。2、酸性染料酸性染料的选择的选择 常用的有溴酚蓝、溴甲酚常用的有溴酚蓝、溴甲酚绿、溴麝香草酚蓝等绿、溴麝香草酚蓝等3、合适的合适的有机溶剂有机溶剂 要求对生物碱与酸性染料要求对生物碱与酸性染料的结合物有很好的溶解度。氯仿、二氯甲烷的结合物有很好的溶解度。氯仿、二氯甲烷苦味酸盐法苦味酸盐法利用生物碱与苦味酸盐形成离子对而呈色。利用生物碱与苦味酸盐形成离子对而呈色。适用于在弱酸性或中

13、性溶液中能与苦味酸定适用于在弱酸性或中性溶液中能与苦味酸定量发生沉淀的生物碱。量发生沉淀的生物碱。雷氏盐比色法雷氏盐比色法 雷氏盐又称硫氰酸铬铵雷氏盐又称硫氰酸铬铵(NH4Cr(NH3)2(SCN)4.H2O)中药制剂经过净化处理后，其中生物碱与雷氏盐能中药制剂经过净化处理后，其中生物碱与雷氏盐能生成难溶于水而易溶于丙酮的红色络合物，可于生成难溶于水而易溶于丙酮的红色络合物，可于520526nm波长处比色测定其吸收度，再换算波长处比色测定其吸收度，再换算为生物碱的含量。也可通过间接测定滤液中残存的为生物碱的含量。也可通过间接测定滤液中残存的过量雷氏盐的方法计算含量。过量雷氏盐的方法计算含量。（

14、三）色谱法（三）色谱法1、高效液相色谱法、高效液相色谱法离子对色谱、正相色谱、反相色谱。离子对色谱、正相色谱、反相色谱。局限性：局限性：1、由于硅胶上具有弱酸性硅醇基，易吸附、由于硅胶上具有弱酸性硅醇基，易吸附产生拖尾，常在溶剂中加入碱性改善剂，如产生拖尾，常在溶剂中加入碱性改善剂，如氨、二乙胺、三乙胺，但在碱性系统下硅胶氨、二乙胺、三乙胺，但在碱性系统下硅胶G的稳定性较差的稳定性较差2、因使用的多数流动相含有相对高比例的、因使用的多数流动相含有相对高比例的极性改善剂，如醇或碱，以及样品中存在的极性改善剂，如醇或碱，以及样品中存在的水或流动相中的水，易使硅胶浸润而失活。水或流动相中的水，易使硅

15、胶浸润而失活。正相正相HPLC：（1 1）、流动相方面的改进）、流动相方面的改进 A A：加入：加入硅醇基抑制剂硅醇基抑制剂，可在流动相中抑制或掩，可在流动相中抑制或掩蔽固定相表面的游离硅醇基的活性，使生物碱易蔽固定相表面的游离硅醇基的活性，使生物碱易出峰，峰形好。出峰，峰形好。最常用的有最常用的有二乙胺、三乙胺二乙胺、三乙胺；B B：加入：加入离子对试剂离子对试剂，使其与生物碱生成离子对，使其与生物碱生成离子对而掩蔽其碱性基团，从而不会与固定相表面的硅而掩蔽其碱性基团，从而不会与固定相表面的硅醇基作用；醇基作用；常用辛烷磺酸钠或十二烷基磺酸钠表常用辛烷磺酸钠或十二烷基磺酸钠表面活性剂。面活性

16、剂。 注意：柱子及时清洗注意：柱子及时清洗反相反相HPLC的改进：的改进：C C：也可以加入：也可以加入季铵盐试季铵盐试剂剂， RR3 3SioH + A RSioH + A R3 3SioH.ASioH.A硅醇基硅醇基 季铵盐季铵盐 复合物复合物连续添加季铵盐时，平衡向右，因而被分连续添加季铵盐时，平衡向右，因而被分离的生物碱和硅醇基之间的作用被阻碍，离的生物碱和硅醇基之间的作用被阻碍，从而使生物碱得到很好的分离。从而使生物碱得到很好的分离。 常用有溴化四甲基胺常用有溴化四甲基胺D：在流动相中加入一定浓度电解质在流动相中加入一定浓度电解质缓冲盐缓冲盐，可改变流动相离子强度，稳定可改变流动相离

17、子强度，稳定pH值及促进离值及促进离子对作用，从而改善峰形及分离效果。子对作用，从而改善峰形及分离效果。 通常用通常用磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液，但操作时由于存，但操作时由于存在盐，做过后应充分洗柱，以免腐蚀柱子。在盐，做过后应充分洗柱，以免腐蚀柱子。（2）、固定相方面的改进）、固定相方面的改进A：选择：选择C链较短的键合相硅胶为固定相链较短的键合相硅胶为固定相，如，如C8比比C18好，原因是由于硅烷的好，原因是由于硅烷的C链较短则覆链较短则覆盖硅胶的表面较好，只有较少的游离硅醇基。盖硅胶的表面较好，只有较少的游离硅醇基。B：封尾技术可使填料的键合更彻底，常用三封尾技术可使填料的键合更彻底，常用三甲基氯硅烷（甲基氯硅烷（TMCS）处理，可减少残余羟基，）处理，可减少残余羟基，增加单体覆盖度。增加单体覆盖度。（3）、增加流动相的脂溶性）、增加流动相的脂溶性（