川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多

1、川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究         09-08-30 14:20:00     编辑：studa20               作者：陈要臻，王岚，马逾英，张正银，樊哲仁，唐琳【摘要】  目的寻找川芎的高效分子标记。方法以四川崇州都江堰、新都3个产地的川芎为材料，应用100

2、 条简单序列重复间区多态性（ISSR）引物、64对扩增片段长度多态性（AFLP）引物对30个川芎个体进行多态性筛选。结果筛选到简单序列重复间区多态性特异性引物共10 条，扩增片段长度多态性特异性引物共6对；分别扩增出106和256条条带，多态条带百分率分别为22.64%和 22.27%。平均标记指数AFLP 的检测效率(1.78)明显高于ISSR(0.42)。两种标记基于遗传相似值聚类分析结果存在着一定的差异,但用Mantel测试对两种方法检测的遗传一致度进行相关性分析表明,它们之间存在着显著的相关性( r=0.6975，p=0.014)。结论川芎具有较低的遗传多样性，AFLP更有效于ISSR

3、。 【关键词】  川芎 简单序列重复间区多态性 扩增片段长度多态性川芎Ligusticum chuanxiong Hort.为伞形科藁本属的多年生植物，是著名传统中药材。以根茎供药用，具有活血行气，祛风止痛的功效，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、头痛、风湿痹痛等1。在中国普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州、江苏等省。四川为川芎道地产区2，川芎已有一千五百多年栽种的历史。长期的自然选择和人工选择使不同产地的川芎从外部形态到有效成分的组成及含量上均存在一定差异3。但目前有关川芎的研究大多集中在药用成分分析，药理作用等方面3，4，遗传多样性研究几乎是空白。因此，寻找高

4、效率鉴定川芎不同种质资源的有效分子标记技术方法具有重要意义。    简单序列重复间区多态性 (ISSR)和 扩增片段长度多态性(AFL P)这两种分子标记方法已在遗传群体结构分析、亲缘关系分析以及基因图谱构建等方面得到了应用58。ISSR与AFLP标记均具有无需预先知道受试基因组DNA序列, DNA用量少,灵敏度高,对反应条件不敏感,重复性好,能提供丰富的关于基因组的信息等优点, 一般而言, AFLP具有更高的灵敏度,能检测出更高的遗传多样性,但所需仪器和药品价格昂贵,实验成本高,检测过程繁琐；ISSR分子标记技术具有操作简单、实验成本低的优点，但灵敏度不高。选择

5、合适的分子标记对能否客观反映研究对象的状况具有重要的影响9 。本研究对ISSR和AFLP 两种分子标记方法进行了比较研究, 旨在寻找适合川芎的高效分子标记, 以期为川芎的真伪辨别、遗传育种及种质资源的保护和合理利用提供科学依据。1 材料30个川芎样品采自四川崇州(编号110)、都江堰(编号1120)、新都(编号2130)，每样株间隔距离至少5 m以上，每株采集的叶片迅速装入自封袋中用硅胶干燥保存，并尽快进行总基因组DNA的提取。2 方法2.1 基因组DNA的提取采用CTAB,并进行改良10。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度仪测定DNA浓度。2.2  ISSR扩增及检测I

6、SSR引物(UBC set No.9) 由加拿大哥伦比亚大学提供。从100条引物筛选出扩增条带清晰、重复性较好的引物用于PCR扩增。ISSR反应体系为 25 l,包括2 l DNA模板( 25 ng/l ) 、0.5 l引物( 1 mmol/L)、5 l dNTP (1 mmol/L)、2 l 10 ×PCR buffer，1 U rTaq DNA聚合酶和14.5 l ddH2O。dNTP，rTaq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司;扩增反应在PTC100TM(Programmable Thermal Con2troller, MJ Research Inc ,美国) PCR扩增仪

7、上进行; PCR反应程序为: 94 预变性5 min; 94 变性30 s，4852 退火45 s，72 延伸2 min,共计45个循环; 72 延伸7 min; 4 10 min终止反应;扩增反应结束后,用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE) ,电压80 V,电泳时间30 min,然后用EB染色,凝胶成像系统照相,观察扩增结果。2.3 AFLP扩增及检测接头与引物按照文献11提供的序列,由北京赛百盛公司合成。从选择性引物中筛选出条带清晰、反应稳定的引物组合进行AFLP分析; AFLP反应参照文献12进行。取400 ng总DNA用EcoR (Biolabs)和Mse(Biolabs)双酶

8、切,酶切产物用T4 - 连接酶( TaKaRa)与接头连接;然后用无选择性碱基的引物进行预扩增,预扩增程序为:94 变性2 min, 94 变性30 s, 56 退火30 s, 72 延伸1 min, 30个循环后, 72 延伸5 min, PCR反应结束后,置4 保存。取10 l预扩增产物0.1×TE稀释10倍,作为选择性扩增反应模板;选择性扩增采用“Touch down”策略。反应程序为: 94 变性2 min, 94 变性30 s, 65 退火30 s (每个循环降低0. 7 ) , 72 延伸1 min,共12个循环; 94 变性30s, 55.5退火30 s, 72 延伸1

9、 min,在进行23个循环后, 72 延伸5 min， PCR反应结束后，置4 保存；5 l选择性扩增产物样品加入等体积甲酰胺染液在95 加热5 min后立即在冰浴中冷却。以100 bp Ladder marker作参照，用6%的变性聚丙烯酰胺胶,70 W预电泳45 min，上样后75 W电泳70 min；银染,照相,观察扩增结果。2.4 数据分析将ISSR，AFLP扩增产物每个条带均视为一个分子标记(maker)，代表一个引物的结合位点。按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带(包括弱带)的记为“1”，无带的记为“0”的格式分别输入构成的ISSR表型和AFLP表型数据矩阵用于进一步的分析

10、。应用POPGENE1. 32软件对30个个体进行遗传参数分析,计算多态位点百分率( PPB, percentage of polymorphic bands) 、观测等位基因数(Na , Observed number of alleles ) 、有效等位基因数(Ne , Effective number of alleles) 、Nei基因多样性(H,Neis gene diversity) , Shannon信息指数( I, Shannons Information index) 、Nei遗传距离(1978) (genetic distance)与遗传一致度(genetic identi

11、ty)等参数。并计算评价分子标记效率参数13：有效多态率（Effective multiplex ratio，E）和标记指数(marker index ，MI)。E = n × PPB(n为每对平均引物扩增的条带数)；MI = E × H。用NTSYS-pc Version 2.10e 软件进行UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic average,非加权配对算术平均法)聚类分析，得到30个样品的聚类树状图。用TFPGA软件的Mantel检验软件检测这两种标记的相关性。3 结果3.1 ISSR与AFLP的多态性

12、效率比较利用合成的100条ISSR引物对30个川芎进行PCR 扩增，初步筛选10条引物(见表1)。这10条ISSR引物共产生了106条扩增条带(1502 700 bp),其中24条是多态性的(见图1)。利用合成的64对AFLP随机引物对30个川芎进行PCR 扩增, 初步筛选6对引物(见表2)。这6对AFLP引物共产生了256条扩增条带(50500 bp), 其中57条是多态性的(见图2)。AFLP扩增得到的多样性参数高于ISSR扩增得到的结果(见表3)。对于ISSR 分析,引物多态性(PPB)为22.64%，每个位点的有效等位基因数(Ne)是0.3218,Shannon信息指数(I)是0.25

13、4 1，Neis基因多样性(H)为0.1766，有效多态率(E)和标记指数(MI)分别为2.40和0.42；对于AFLP分析, PPB为22.27% ,每个位点的有效等位基因数(Ne)是0.351 8,Shannon信息指数(I)是0.269 4，Neis基因多样性(H)为0.189 5，有效多态率(E)和标记指数(MI)分别为9.42和1.78。表1   筛选出的ISSR引物序列及扩增条带数目（略）表2  筛选出的AFLP引物序列及扩增条带数目（略）3.2 同样样本遗传距离与聚类结果比较根据ISSR 分析表明, Neis 遗传距离介于0.029 50.074 4

14、之间，所有个体的平均遗传距离为0.0518 5，新都种群与都江堰种群之间的遗传距离较大，崇州种群与都江堰种群之间遗传距离较小。遗传一致度的变化范围为0.931 80.978 3，平均遗传一致度为0.956 2；AFLP分析得到的30个川芎的遗传距离在0.025 40.070 7之间，平均遗传距离为0.050 2，其中崇州种群与都江堰种群之间遗传距离较小，崇州与新都种群之间的遗传距离最大；遗传一致度在0.932 00.971 1之间，平均遗传一致度为0.955 4。两种标记的结果均说明，川芎在崇州、都江堰和新都种群之间的相似性较高但也存在着相当程度的遗传分化。但是二者揭示的结果有一定的差异。用N

15、TSYS-pc Version 2.10e 软件计算了基因遗传相似度，进而用UPGMA法聚类，结果(见图34)表明，ISSR和AFLP标记分别得到了基本相近但不完全相同的聚类图。对于ISSR分析来说，崇州的10个个体(110)聚在了一起，都江堰(1120)和新都(2130)出现了极个别的交叉。AFLP分析来看，都江堰的聚在一起，崇州的分成了两部分，新都的也分成了两部分。表3  ISSR 与AFLP 分子标记比较（略）3.3 ISSR与AFLP之间的相关性分析为了检测ISSR与AFLP分析的相关程度,利用Mantel检验对基于两种标记的遗传一致度矩阵进行相关性分析。结果表明，两种标记分析的遗传一致度的成显著的正相关( r =0.6975,P=0.014)。4 讨论4.1 多态性效率比较分析ISSR和AFLP的效率对比研究表明，川芎具有较低的遗传多样性以及ISSR和AFLP的多态性得率很接近。