实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程

1、实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程序的探讨蒋玲丽王雪亮王华梁肖艳群摘要目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR 检测病毒核酸的方法学性能验证程序。方法参考美国国家临床实验室标准化协会(CLSI 颁布的相关文件对实验室开展PCR 检测病毒核酸进行方法学性能验证;通过稀释标本直至低于检测下限进行定量检出限验证实验。结果乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA 检测的批内精密度(CV 批内分别为4.28%和2.08%;总精密度(CV 总为4.14%和2.69%;与比对方法回归方程为y=1.1082x-0.5225;线性相关系数为0.9976,回归方程为y=0.9771x-0.0062,线性范围

2、为1.08E31.05E8;定量检出限为500 IU/mL 。丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA 检测的CV 批内分别为4.11%和2.63%;CV 总为5.15%和3.41%;与比对方法回归方程为y=1.0075x-0.0662;线性相关系数为0.9974,回归方程为y=1.0479x-0.2594,线性范围为1.50E32.53E7;定量检出限为1000 IU/mL 。结论实验室开展PCR 检测项目前有必要进行方法学验证,根据实际情况选择实验方案和统计方法可减少人力和财力。关键词精密度;正确度;性能验证Discussion of the performance verification pr

3、ocedures of the real-time quantitative polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acidJIANG Lingli ,WANG Xueliang ,WANG Hualiang ,XIAO Yanqun (Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, ChinaABSTRACTObjective To discuss the reasonable performance veri cation procedur

4、es of real-time quantitative uorescent polymerase chain reaction for determination of virus nucleic acid.Methods The performance veri cation procedures were applied according to the related documents published by Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI. The limits of quanti cation were veri

5、 ed by diluting the samples to which can not be tested.Results The within-run coef cient of variation(CV of HBV-DNA were 4.28% and 2.08%, the total CV were 4.14% and 2.69% and the regression equation was y=1.1082x-0.5225; the correlation of linearity was 0.9976, the regression equation was y=0.9771x

6、-0.0062, the linearity range was 1.05E31.05E8 and the limit of quantitation was 500 IU/mL. The within-run CV of HCV-RNA were 4.11% and 2.63%, the totalCV were 5.15% and 3.41%, the regression equation was y=1.0075x-0.0662; the correlation of linearity was 0.9974,the regression equation was y=1.0479x-

7、0.2594,the linearity range was 1.50E32.53E7 and the limit of quantitation was 1000 IU/mL.Conclusion It is necessary to run the performance veri cation procedures before using new tests in clinical laboratory. The performance veri cation procedures of quantitative PCR for testing nucleic virus and th

8、e statistics methods are selected on the basis of practical situations.KEY WORDSPrecision; Correctness; Performance veri cation作者单位:上海市临床检验中心,上海 200126通讯作者:肖艳群,E-mail :xiaoyanqun检测系统或方法学的分析性能评价是临床检验质量管理的重要内容。根据美国临床实验室改进法案修正案(Clinical Laboratory ImprovementAmendment 88,CLIA88规定,美国病理家学会(College of Ame

9、rican Pathologists ,CAP 认可的实验室在开展某一检测项目前需提供并保留相关的方法论 著学验证实验数据1。医学实验室质量和能力认可准则(ISO151892007指出实验室应评估工作所选用的方法和程序2。ISO15189是国际医学界普遍承认并遵照执行的关于医学实验室质量和能力方面要求的国际标准,其技术要素5.3.2中指出应确定设备(在安装时及常规使用中能够达到所要求的性能标准。毕波等3指出不同的检测项目和检测系统需选择不同的方法学验证程序。PCR 定量检测病毒核酸实验程序繁琐,涉及手工操作步骤多,并且由于其检测成本高及某些特殊项目的阳性标本稀缺,其方法学验证程序和统计方法常困

10、扰检验人员。笔者于本实验室对定量PCR 检测HBV-DNA 和HCV-RNA 的方法学验证过程进行探讨。1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源HBV-DNA 标本来自上海东方医院,HCV-RNA 标本来自上海仁济医院东院。所有标本在分离血清后当天收集并于-20保存备用。1.1.2仪器Roche LightcyclerII 荧光定量检测仪、HB-100型恒温金属浴、Biofuge-Fresc O 高速冷冻离心机。1.1.3试剂HBV-DNA 、HCV-RNA 均为上海科华生物工程股份有限公司生产,批号分别为20111212和20111210。2方法2.1精密度评价参照EP15-A 文件4。每天

11、分析1个批次,2个浓度样本,每个样本重复测定4次,连续检测5天。HBV-DNA 样本为高低两个浓度质控品;HCV-RNA 低浓度样本为质控品,高浓度样本为临床收集标本。质控品均为本中心产品,批号为1101。参照文献5计算批内精密度(CV 批内和总精密度(CV 总2.2正确度评价采用EP9-A2文件6。从已通过临床基因扩增检验实验室技术验收的实验室中收集临床标本各40例,标本浓度尽量涵盖线性范围。收集后的标本在一周内集中检测,每个标本重复检测2次。取均值与医院检测系统结果进行比对。计算两者线性相关系数(R ,并进一步计算两个项目各自的回归曲线。根据Westgard 7提出的计算方法,分别计算当检

12、测值log10=3、4、5、6、7时的允许总误差(total error ,TE 。计算TE =偏倚(Bias +3CV (这里的CV 采用精密度性能评估中两个浓度的精密度均值,与目标TE 比较(目标TE 为厂商允许的总误差10%,TE0.05,表明两个项目与比较系统的检测结果无显著性差异。3.2.2计算HBV-DNA 和HCV-RNA 两个项目与比较系统的回归曲线,结果见图1。3.2.3并计算理论值在3、4、5、6、7时的TE 与目标TE 比较。计算TE 的结果见表3。3.3 线性范围验证结果见图2。 3.4 定量检出限验证结果见表4。HBV-DNA HCV-RNA R 值0.96850.9

13、564厂商声明(与标准品0.970.97一致性检验P =0.3104P =0.6379表2与比较系统相关性评价结果Table 2The correlation results between testing methods andcomparative methods 理论值(log10=计算TE=Bias+3CV计算TE=Bias+3CV313.44%10.02%49.08%9.46%5 6.47%9.13%6 4.73%8.91%73.48%8.76%表3TE 的计算结果Table 3The results of calculating TE与目标TE (10%比较,0.05,实验方法与比

14、对方法之间的检测结果没有统计学差异。根据Westgard 7提出的方法进一步通过回归曲线计算,同时将理论值为37的值代入后计算总误差。从表3可以看出,除了理论值为3时两个项目的允许总误差超过了厂方声明的10%的指标外,其余均在10%以内。因为厂方声明的允许总误差给出的是一个平均值,并未告知具体的浓度水平,且低浓度标本的允许误差本身就大于高浓度水平,所以,当理论浓度为3时两个项目的允许误差分别为13.44%和10.02%,仍被认为可以接受。用于线性范围验证的样本应覆盖检测系统的整个范围。从图2可以看出,两个检测项目的线性符合厂家声明。但也有文献指出,对于多点校准的检测项目,一般不需要进行分析测量

15、范围来评价实验13。对于新开展的检测系统含有多点校准时是否需要线性范围的方法学验证仍有待探讨。定量检出限是指能可靠检出分析物的最低实际浓度,其验证对于PCR检测项目非常重要。EP-17A 文件指出,验证厂家声明的定量检出限至少需25个重复测量,每个样品的重复检测结果与该样品的参考值和误差目标进行比较,超过该误差目标的结果数是该水平方法是否合适的度量。由于许多PCR检测项目缺乏相应的参考物质,即使有,价格也非常昂贵,在实际工作中,这个验证方案难以实施。我们在进行定量检出限验证时采用临床标本,在基于精密度、正确度和线性范围验证实验接受的情况下,对45浓度的标本进行稀释至有低于检测下限的结果出现,以

16、全部大于检出限且CV在或接近厂方允许的范围时的浓度为可接受的定量检出限。在我们的实验中,HBV-DNA项目在500 IU/mL时全部检出,并且CV为4%,因此认为其定量检出限和厂家声明一致;而HCV-RNA项目在500 IU/mL时有7个低于检测下限,在1000 IU/mL时则全部检出,并且CV为11%,故认为HCV-RNA的定量检出限与厂家声明的500 IU/mL不一致,应为1000 IU/mL。综上所述,根据分子生物学专业的特点,在开展PCR检测项目前,需对精密度、正确度、线性范围、定量检出限等方法学性能进行验证,使用初始浓度值Q DNA转化为对数LGQ进行统计,同时可根据检测项目的类别、

17、是否有参考物质等实际情况选择验证方案和统计方法,即能满足实验室检测质量的要求,又能减少人力和财力。参考文献1 Department of Health and Human Service, Centers forMedicare&Medicaid Services. Clinical laboratory improvement amendments of 1988: nal ruleS. Fed Register, 2003: 3704.2 CNAS-CL 02, 医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189S. 2007: 22.3 毕波, 吕元. 定量检测方法学性能验证的系统设计J.

18、中华检验医学杂志, 2007, 30(2: 9-11.4 Clinical and laboratory standards institute. User vericationof performance for precision and trueness:approved guideline-second editionS. EP15-A2, CLSI, 2005.5 王薇, 王治国, 李少男. 临床实验室对厂家声明的精密度和真实度的性能验证要求J. 检验医学, 2010, 25(12: 1001-1005.6 NCCLS EP9-A2. Method comparison and bi

19、as estimationusing patient samples; approved guideline-second editionS.Wayne, PA: NCCLS, 2002.7 Westgard J O, Barry P L, Quam E F. Basic method validation3rd editionP: training in analytical quality management for healthcare laboratoriesM. Westgard Quality Corporation.1999: 131.8 NCCLS. Evaluation of the linearity of quantitative measurementprocedures: A statistical approach. Approved guideline NCCLS document EP6-AS. Wayne, Pa: NCCLS, 2003.9 余男, 甘明, 詹希美, 等. 乙型肝炎病毒核酸定量检测中不确定度的研究J. 热带医学杂志, 2007, 7(4: 310-314. 10 Zacher B J, Moriconi F, Bowden S, et al. Multicenterevalua