植物组织中有机酸的提取方法比较

1、植物组织中有机酸的提取方法比较董园园,董彩霞,卢颖林,缪辰,沈其荣3(南京农业大学资源与环境科学学院,江苏南京210095摘要:以番茄果实和不结球白菜叶片为试验材料,用蒸馏水(水提、80%乙醇旋转蒸发浓缩(醇提、蒸馏水冷冻干燥浓缩(水提冻干分别提取有机酸,采用高效液相色谱法测定。结果表明:3种提取方法下番茄果实中富马酸、丁二酸含量无显著性差异,草酸、酒石酸、苹果酸、草酰乙酸含量均以水提最高,而丙酮酸和柠檬酸以醇提含量最高;不同提取方法对不结球白菜叶片中草酸、酒石酸、富马酸含量无影响,其他几种有机酸(除草酰乙酸外均以水提和水提冻干含量高于醇提,其中,水提法和水提冻干法提取丙酮酸、苹果酸、丁二酸的

2、含量无显著差异,而柠檬酸含量以水提冻干法最高。综合考虑试验步骤和结果等各方面因素发现,蒸馏水直接提取法既能有效保证有机酸的提取量,又能大大简化试验步骤。关键词:高效液相色谱;植物组织;果实;有机酸中图分类号:O658文献标识码:A 文章编号:10002030(200504014004Study on the methods of extracti on organ i c aci ds fro mdi fferent pl ant tissue by HP LCDONG Yuan 2yuan,DONG Cai 2xia,LU Ying 2lin,M I A O Chen,SHEN Q i 2r

3、 ong3(College of Res ources and Envir on mental Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China Abstract:I n this experi m ent,organic acids were extracted fr om t omat o fruit and Chinese cabbage leaves by different extracti on methods,such as by distilled water directly (W ,by 80%eth

4、anol and then evaporati on for concentrati on (E ,and by distilled water f or extracti on and then fr ozen 2evaporati on concentrati on (W F and then deter m inated by HP LC .The results obtained are lis 2ted as f oll ows .I n ter m s of t omat o fruits,the extracted a mounts of fu marate and succin

5、ate were not influenced by extracti on meth 2ods,while the a mounts of oxalic acid,tartaric acid,malate and oxal oacetate extracted byW method were significantly higher than those extracted by the other t w o methods .E method could extract the highest amount of pyruvate and citrate .For Chinese cab

6、bage leaves,no significant differences were found in oxalic acid,tartaric acid and fu marate extracted by the three extracti on methods,whereas the a mount of the other organic acids (excep t for oxal oacetate extracted by W and W F method were significantly higher than those extracted by E method .

7、There were no significant difference of pyruvate,malate,and succinate extracted byW and W F method while citrate amount extracted by W F was higher than that by W.Therefore,distilled water extracti on (W method wasp r oposed t o extract organic acids fr om t omat o fruits and Chinese cabbage leaves

8、when taking the extracti on step s,working efficiencyand extracti on quality t ogether int o account .Key words:HP LC;p lant tissue;fruit;organic acids有机酸广泛存在于水果、蔬菜中,其种类和含量是决定果蔬风味的重要指标,也是果蔬成熟度、耐储藏性、加工性的重要依据,因此测定果蔬中有机酸的种类及含量具有重要的意义。有机酸的测定方法主要有3种,蒸馏水直接提取法1,2,乙醇旋转蒸发提取法35,乙氰、甲醇提取法6,7。由于乙氰、甲醇成本高且有毒性,因此较少

9、使用。根系分泌物中有机酸含量的分析步骤通常采用蒸馏水提取冷冻干燥(或旋转蒸发浓缩溶解HP LC 分析8。为了确保植物组织中有机酸的高效提取和分离,我们也将此法运用于植物组织中有机酸的分析。目前大部分研究均是采用一种方法提取一种材料中的有机酸,而不同提取方法对同一种材料提取效收稿日期:20050111基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270790;中国博士后科学基金资助项目(2003033494作者简介:董园园(1981,硕士研究生,E 2mail:qianlicao99sina 1com 。3通讯作者Corres ponding author:沈其荣(1957,教授,从事植物氮素营养研究

10、,Tel:025*,E 2mail:qrshennjau 1edu 1cn 。南京农业大学学报2005,28(4:140143Journal of N anjing A gricultural U niversity果的比较分析较少。不同的试验材料,如植物的果实和叶片, 由于组织结构和物质种类的差异,不同的提取剂和提取方法所能提取到的有机酸量会相差很大。因此,本研究用不同提取方法对不同植株器官有机酸的提取进行比较,以期能寻找到一条既能一次性提取多种有机酸又能简化试验步骤提高工作效率的途径。1试验条件与方法111仪器与试剂W aters6002487高效液相色谱仪,紫外检测器,上海亚荣长化仪器厂

11、RE52C旋转蒸发仪,美国Sa want公司S ML2400s冰冻干燥机。有机酸标准品:草酸、酒石酸、草酰乙酸、丙酮酸、2酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、丁二酸均为分析纯试剂,苹果酸采用Sig ma公司产品。112色谱条件色谱柱:德国Merck公司生产的H ibar column RT250mm×416mm C18柱,填料直径5m,柱温30,流动相为015%(NH42HP O42H3P O4(pH215缓冲液,使用前用0145m滤膜抽滤,流速为1mLm in-1,紫外检测波长214n m,进样量20L。113样品采集番茄L ycopersicon esculentum(21世纪宝粉和不结球

12、白菜B rassica chinensis(南农矮脚黄采用蛭石培养,浇灌Hoagland营养液,以番茄第一果位成熟的大小均匀的果实和不结球白菜莲座期倒三叶为试验材料。114有机酸提取11411蒸馏水直接提取(简写为水提,W参照沈宏等方法9。番茄果实约20g用打浆机打碎,准确称取匀浆后的番茄5100g,加入20mL蒸馏水,于75水浴中提取15m in;以20000rm in-1离心20m in,上清液过0122m滤膜后进行HP LC测定。称取剪碎混匀的不结球白菜叶片2150g置于研钵中,加入3mL蒸馏水和少许石英砂,研磨成匀浆,移入10mL离心管中,再用1mL蒸馏水洗涤研钵2次并转移至离心管,总

13、体积为5mL,于75水浴中提取15m in;以20000rm in-1离心20m in,上清液过0122m滤膜后进行HP LC测定。1141280%乙醇旋转蒸发浓缩提取(简写为醇提,E参照李连朝等方法3。将11411中提取液改为80%乙醇溶液,称样、研磨、水浴、离心步骤同上。番茄沉淀用10mL80%乙醇溶液洗涤2次,上清液定容至50mL;不结球白菜叶片沉淀用2mL80%乙醇溶液洗涤2次,上清液定容至10mL,于旋转蒸发仪75蒸干,番茄残渣加20mL(不结球白菜叶片用5mL流动相溶解,过0122m滤膜,然后进行HP LC测定。11413蒸馏水冷冻干燥提取(简写为水提冻干, W F参照郜红建等方法

14、8。称样、研磨、水浴、离心步骤同11411。番茄沉淀用10mL蒸馏水洗涤2次,上清液定容至50mL;不结球白菜叶片沉淀用2mL蒸馏水洗涤2次,上清液定容至10 mL,于冰冻干燥机中冷冻干燥,番茄沉淀加20mL (不结球白菜叶片用5mL流动相溶解,过0122m滤膜后进行HP LC测定。115数据处理所有数据处理均采用SPSS2LS D法。2结果与讨论2119种有机酸标准品HPLC分析色谱图由图1可见,用HP LC分析法在15m in 内同时t/m in图19种有机酸混合标准品色谱图F i g11Chro ma togram of a m i xture of9organ i c ac i dst

15、 andards(1.草酸Oxalic acid; 2.酒石酸Tartaric acid; 3.草酰乙酸Oxal oacetate; 4.丙酮酸Pyruvate; 5.苹果酸Malate; 6.2酮戊二酸,2Ket oglutarate;7.柠檬酸Citrate;8.富马酸Fumarate;9.丁二酸Succinate.The sa me as Fig12.141第4期董园园等:植物组织中有机酸的提取方法比较测定草酸、苹果酸、柠檬酸等9种有机酸是可行的,各种酸的出峰时间较为稳定而且互不干扰。212不同提取方法所得番茄果实和不结球白菜叶片各种有机酸含量从图2可以看出,在3种不同提取方法下8种有机

16、酸(其中2酮戊二酸均未测出的出峰时间比较一致且与标准图谱基本相同,但其峰面积则存在不同程度的差异。不结球白菜叶片醇提和水提冻干法中草酸峰过高,可能是被NO -3或S O 2-4干扰所致,同时该法测定草酸时回收率偏高,也会使最终结果偏高10 。图2番茄果实(A和不结球白菜叶片(B有机酸的HP LC 色谱图F i g 12Chro ma togram of 8organ i c ac i ds extracted fro m to ma to fru it (Aand Ch i n ese cabbage leaves (Bby three d i fferen t extracti on m e

17、thods:W ,E and W F(W ,E and W F stand f or distilled water directly,80%ethanol and then evaporati on for concentrati on,and distilled water for extracti on andthen fr ozen 2evaporati on concentrati on,res pectively .The sa me as in Table 1.对番茄果实和不结球白菜叶片中各种有机酸的含量(以鲜重计进行计算,表1结果表明,3种提取方法对番茄果实内富马酸、丁二酸含量

18、基本无影响,其他几种有机酸含量则由于提取方法的不同而各有差异,其中除柠檬酸和丙酮酸以醇提最高外,草酰乙酸、苹果酸、酒石酸和草酸均以水提为最高。3种方法提取不结球白菜叶片中有机酸时,酒石酸、富马酸含量无显著差异,除草酰乙酸以醇提含量较高外,丙酮酸、苹果酸和丁二酸含量均以水提和水提冻干法显著高于醇提,其中水提法和水提冻干法中的丙酮酸、苹果酸和丁二酸含量无显著差异。柠檬酸含量以水提冻干法含量高于其他两种提取方法。241南京农业大学学报第28卷表1不同提取方法所得番茄果实和不结球白菜叶片中8种有机酸含量Table 1E i ght organ i c ac i ds con ten ts extrac

19、ted fro m to ma to fru it and Ch i n ese cabbage leavesby three d i fferen t extracti on m ethodsmg kg-1作物种类Plants有机酸种类O rganic acids提取方法Extracti on methods水提W 醇提E 水提冻干W F番茄果实草酸Oxalic acid31515±4511a 27114±4916ab 22810±717b T omat o fruit酒石酸Tartaric acid 114118±1313a 79217±1

20、1315b 75415±7418b 草酰乙酸Oxal oacetate 5517±1511a 1810±415b 1716±212b 丙酮酸Pyruvate 610±117b 1014±313a 313±110c 苹果酸Malate 170413±1512a 71815±12318b 175114±19210a 柠檬酸Citrate 2514±719b 6318±1711a 4313±1515ab 富马酸Fumarate 6510±0115a 6113&#

21、177;0112a 6113±0114a 丁二酸Succinate 117013±18013a 100513±9412a 107812±5811a 总酸Total448318±27818a294114±73612b393715±35114a不结球白菜叶片草酸Oxalic acid 1391112±161517a1521517±196718a 1356716±130611a Leaves of Chinese cabbage酒石酸Tartaric acid 36119±7214a 477

22、19±9112a 39711±10714a 草酰乙酸Oxal oacetate 6717±1610a 5815±1412a 3419±713b 丙酮酸Pyruvate 3313±318a518±017b 3516±514a 苹果酸Malate 832018±82914a 146616±18117b 925113±114411a 柠檬酸Citrate 29514±3713b 29010±4610b 84812±8614a 富马酸Fumarate 12712&

23、#177;912a 12310±211a 12317±613a 丁二酸Succinate 9578619±1430017a 232813±12617b 9745715±1112515a 总酸Total11890413±1688411a1996517±243015b12171518±1378816a3讨论与结论水提冻干法是借鉴了根系分泌物中有机酸含量的分析方法,因为根系分泌物的提取通常是在大量介质中进行的,致使目标物质含量太低,分析误差太大,因此采用冷冻干燥的方法将其进行一定比例的浓缩以达到精确分析的目的。在本试验中,考虑到植物组织中有机酸含量的提取也可能存在这方面的问题,因此,将水提后的上清液进行冷冻干燥浓缩,结果表明,经过浓缩后的样品只有柠檬酸的含量大大提