BCA蛋白浓度测定

1、BCA蛋白浓度测定一、实验原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示最大吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。二、试剂盒说明：1. 检测浓度下限达到10g/mL，最小检测蛋白量达到0.2g，待测样品体积为1-20L。在20-1000g/mL浓度范围内有较好的线性关系。2. BCA法测定蛋

2、白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，-巯基乙醇低于0.01%。这些不适用BCA法的样品，可以使用Bradford蛋白浓度测定法。注：双向电泳裂解液中有较高含量的DTT，所以不能使用BCA法测定，或者是测完浓度上样前再加入DDT。三、保存条件：A、B液室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20冻存。四、操作步骤：1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪。2. 配制25mg/mL蛋白标准溶液

3、母液。取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20长期保存。3. 配制0.5mg/mL蛋白标准溶液取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。取20L25mg/mL蛋白标准，加入980L稀释液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准，并分装到200L的离心管中，每管80L，-20长期保存，需要使用取出一管溶解后使用。注：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。4. 配制BCA工作液按50体积BCA试剂A加1体积BC

4、A试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。根据样品数量计算所需BCA工作液体积，每个样品需要200L的BCA工作液，再加上标准品所需2mL，例如10个样品，所需体积为0.2 mL×10+2 mL =4 mL，取4 mL BCA试剂A，加入80L BCA试剂B，混匀，配制成4.8mL BCA工作液， BCA工作液室温24小时内稳定。5. 将0.5mg/mL蛋白标准溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20L加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20L。6. 加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20L。注：测量浓度请需要对样品进行稀释，使

5、其的浓度范围在0.5-5 mg/mL之间，保证样品浓度在线性范围内，一般样品需要稀释5-10倍即可，根据实际蛋白浓度适当调整。7. 各孔加入200L BCA工作液，37放置20-30分钟。注:也可以室温放置2小时，或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。8. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A562吸光度，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。 五、实验数据及处理测得三次重复实验BSA溶液的吸光度如下：用Excel或orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。六、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线R2值大于0.99的时数据较好。如果R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。注意事项：建议每次