木芙蓉叶提取物对大鼠慢性肝损伤的实验性研究

1、木芙蓉叶提取物对大鼠慢性肝损伤的实验性研究                              作者：沈钦海，秦召敏，孙志军【摘要】  目的观察木芙蓉叶提取物（CHE）对四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肝纤维化的预防作用。方法实验大鼠随机被分为3组，即正常对照组、模型组、CHE预防组。CHE预防组除腹腔注射

2、40%CCl4外，还给予CHE灌胃，1次/d，至第8周，所有大鼠均被处死。收集大鼠血液，检测转氨酶及肝纤维化指标；取不同部位肝组织除检测脂质过氧化外，还进行病理检测。结果与模型组相比，CHE预防组大鼠血清ALT，AST，HA，LN，PC，-C，MDA含量均降低，SOD，GSH-Px，ALB水平升高；病检测肝纤维化程度减轻。结论CHE对CCl4诱导的大鼠肝损伤具有保护作用，而且对其产生的肝纤维化有抑制和减轻作用。 【关键词】  木芙蓉叶提取物； 肝纤维化； 大鼠    木芙蓉属槿葵科木属植物，其花、叶和根均可入药，味微辛,无毒，具有清热解毒、消肿排毒、凉血

3、止血之功效，在民间被广泛用于痈肿疮疖。记载该药外用和口服有很好的抗炎、消肿作用，可以治疗阑尾炎、腮腺炎，也可以治疗关节炎、丹毒等。符诗聪等1研究发现木芙蓉叶有效成分具有明显的抗炎作用。罗仕华等2研究发现木芙蓉叶有效成分对肾缺血再灌注损伤有保护作用。近年来，研究发现木芙蓉叶中主要成分含有芸香苷（芦丁）等黄酮类化合物3，4。黄酮类化合物多有较强的抗自由基作用，对机体氧化损伤有很好的保护作用。本实验通过四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型，探讨CHE预防肝纤维化的作用。1  材料1.1  药品和试剂木芙蓉叶（重庆市三峡库区）采用70%乙醇回流法进行提取, 其主要成分为总黄酮，提取过程参照

4、姚莉韵等5实验方法，通过减压浓缩并真空干燥而获得浸膏（每克浸膏相当于生药47.8 g），然后用蒸馏水稀释备用。透明质酸(HA)、层粘连蛋白（LN）、三型前胶原（PC）、四型胶原（-C）检测试剂盒（上海海军医学研究所）。过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及白蛋白（ALB）检测试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)；转氨酶试剂盒(上海荣盛生物制剂厂)；四氯化碳（重庆西南化学试剂有限公司）。1.2  动物Wistar实验用雄性大鼠，体质量180200 g/只（重庆医科大学动物实验中心提供）。2  方法2.1  分组与给药将35只大

5、鼠随机分为3组：正常对照组（10只），模型组（15只），木芙蓉叶提取物预防组（10只），各组间暴露因素无差异。模型组和干预组给予含40%CCl4的石蜡油溶液，腹腔注射8周，1 ml/kg，2次/周，干预组同时给予木芙蓉叶提取物（CHE），剂量为人体的10倍量灌胃（人木芙蓉叶临床拟用量为生药15 g/d，体重按60 kg计，即0.25 g/kg·d)，1次/d；正常对照组只给予生理盐水1 ml/kg，腹腔注射8周，其中模型组在8周中共有4只死亡。2.1.1  血生化与脂质过氧化指标的检测动物麻醉，摘眼球取血，分离血清,用全自动生化检测仪检测ALT、AST和ALB值，采用放免法

6、检测-C、HA、LN、PC型胶原，按试剂盒说明进行操作。取肝左叶同一部位，比色分析检测肝组织SOD、MDA和GSH-Px的活性。2.1.2  肝组织病理学检测取肝右叶同一部位，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，行HE染色，光镜下观察肝组织炎症及纤维组织增生状况。根据肝组织病理变化，将纤维化分为04级6：0级：无肝纤维化；1级：纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大,有向肝小叶的倾向；2级：纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3并有1级同样的改变；3级：纤维结缔组织进入肝小叶中央周围；4级：纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有3级同样的改变。2.2  统计学分析实

7、验结果经统计学处理，计量资料用 ±s表示，采用SAS6.12软件对两组间均数比较采用t检验，纤维化程度以等级资料表示，并用Ridit检验进行分析处理。3  结果3.1  CHE对肝功能的影响 由表1显示模型组与正常对照组比较差别有显著意义(P<0.01)，说明造模成功；预防组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)水平显著低于模型组（P<0.01），白蛋白（ALB）明显高于模型组(P<0.05)，结果表明CHE预防组有保护肝细胞的作用。表1  CHE对肝纤维化大鼠血清肝功能的影响(略)1    

8、;     3.2  CHE对肝组织脂质过氧化指标活性的作用 由表2可见正常对照组与模型组比较，模型组过氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性降低, 丙二醛（MDA）含量升高，两组差异均有显著意义(P<0.01)；预防组与模型组比较，SOD与GSH-Px活性显著升高(P<0.01)，MDA活性降低(P<0.01)。表2  CHE对大鼠肝脏脂质过氧化指标的作用(略)3.3  肝组织病理变化肝组织苏木精-伊红染色结果显示（见表3），正常对照组未见肝细胞变性、坏死，而模型组大鼠肝

9、脏可见肝索排列紊乱，肝细胞弥漫性水样变性和脂肪变性，门管区及肝小叶内可见明显的灶性淋巴细胞浸润，纤维组织增生明显，肝小叶结构破坏，且增生的纤维将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，纤维化增生程度多为3、4级；CHE预防组大鼠肝细胞变性、坏死明显减轻，结缔组织轻度增生，多为1、2级，未见假小叶形成，统计学分析, CHE干预组较模型组纤维化程度减轻(P<0.05)。表3  各组大鼠肝组织纤维化程度(略)3.4  CHE对血清肝纤维化指标的影响由表4结果显示模型组肝纤维化指标HA 、LN 、PC和C含量显著增加,与正常对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)；CHE预

10、防组可显著降低血清中纤维化指标， LN、PC及HA与模型组相比显著降低(P<0.01)，而-C型胶原的水平也明显下降(P<0.05)。表4  CHE对大鼠慢性肝损伤血清肝纤维化指标的影响(略)4  讨论    肝纤维化是肝脏至肝硬化的必经阶段，而肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的核心环节，氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星状细胞活化的重要机制79，活化的HSC是合成胶原等细胞外基质（ECM）的主要肝纤维化细胞10，抑制肝星状细胞的激活是防治肝纤维化的关键步骤。近来研究发现培养的HSC可以被自由基激活而被抗氧化剂阻断11

11、。大量研究发现黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗菌、抗肿瘤等12，13，但最主要的是它的抗氧化活性，它通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基,从而终止自由基链式反应，从而抑制氧自由基和脂质过氧化反应，这是黄酮类化合物清除自由基的最主要机制。MDA为脂质过氧化的终末产物，其含量反映了组织中过氧化损伤的程度。GSH-Px和SOD是重要的过氧化物分解酶，而且GSH-Px能特异性地催化还原型GSH对过氧化氢的还原反应，从而保护细胞膜结构和功能的完整性。抑制MDA等毒性物质的生成，增强自由基反应酶类如SOD、GSH-Px等活性，减缓氧自由基和脂质过氧化损伤。CHE中含有芦丁等

12、黄酮类化合物，其是否有抗肝纤维化作用？本实验通过研究发现CHE预防组明显降低血浆中HA 、LN 、PC、C及肝组织中MDA的含量，提高肝组织中GSP-Px、SOD活性的作用，且生化结果显示CHE可显著降低AST 、ALT活性、增加ALB的水平，改善肝功能的作用。病理结果表明CHE能明显预防四氯化碳所致的肝损伤、减轻肝细胞变性、炎细胞浸润和坏死等病变，作用机理可能是通过提高肝细胞抗氧化能力、对抗CCl4引起的膜脂质过氧化及保护肝细胞膜结构的完整性而实现的。【】  1符诗聪，张凤华，史炜镔，等.木芙蓉有效成分的抗炎实验研究初步报告J.上海第二医科大学学报，2001，21(1):14.2罗

13、仕华，符诗聪.木芙蓉叶有效组分对大鼠肾缺血再灌注损伤保护作用的实验研究J.湖北中医杂志，2004，26(10):3.3薜申如，刘金旗. 木芙蓉叶化学成分研究J.基层中药杂志，1991，5(4):37.4姚莉韵，陆 阳，陈泽乃.木芙蓉叶化学成分研究J.中草药，2003，34(3):201.5姚莉韵，王国艳，王丽平.木芙蓉叶提取工艺的研究J.中成药，2000，22：827.6Hayasaka A Saisho H. Serum markers as tools to monitor liver fibrosisJ. Digestion，1998，59(4):381.7Lee KS，Lee SJ，P

14、arK HJ，Chung JP，Han KH，Chon CY，Lee SI，Moon YM. Oxidative stress effect on the activation of hepatic stellate cellsJ.Yonsei Med J，2001，42（1）:1.8kang WZ， Xie YM， Nie QH， et al. Effect of oxymatrine on experimental liver fibrosisJ.Shijie Huaren Xiaohua， Zazhi， 2003，11（2）:195.9Wang LT，Zhang B，Chen JJ.Ef

15、fect of anti-fibrosis compound on collagen expression of hepatic cells in experimental liver fibrosis of ratsJ. World J Gastroenterol， 2000，6（6）:877.10HERNANDEZ-MUNOZ R，DIAZ-MUNOZ M，SUAREZ-CUENCA JA，et al.Adenosine reverses a preestablished CCl4-induced micronodular cirrhosis through enhancing collagenolytic acivity and stimulating hepatocyte cell proliferation in ratsJ.Hepatology，2001，34（4PEI）:677. 11Bruck R，Genina O，Aeed H，et al. Halofuginone to prevent and treat thioacetamide-induced liver fibrosis in ratsJ.Hepatology，2002 ，33（2）:379.12Guo Q，