硫酸软骨素提取因素优化研究

1、硫酸软骨素提取因素优化研究陈红丽1,吕全建2,姬小明13(1.河南农业大学农学院,河南郑州450002;2.郑州牧业工程专科学校,河南郑州450008摘要目的为硫酸软骨素的工业化生产提供依据。方法以鸡胸软骨为原料,通过单因素优化试验研究影响硫酸软骨素产率的显著性因素,探索碱液水解法提取硫酸软骨素的最佳工艺条件。结果料液比、提取温度和碱液浓度对硫酸软骨素的产率有较大影响。料液比是影响硫酸软骨素产率的最显著因素,提取温度为次显著因素,而碱液浓度也是影响产率的显著因素。碱液水解法提取硫酸软骨素的最佳工艺条件为:料液比16.75,反应温度40,碱液浓度6%。结论在该条件下,所得硫酸软骨素产品的最高产率

2、为19.75%,纯度为82.59%,氮含量为3.35%,符合国家标准。关键词硫酸软骨素;单因素优化;产率中图分类号O629.12文献标识码A 文章编号0517-6611(200815-06165-02E xperim ental Study on Single F actor Optimization of E xtracting Chondroitin SulfateCHEN H ong 2li et al (C ollege of Agron om y ,H enan Agricultural University ,Z hengzh ou ,H enan 450002Abstract O

3、bjectiveT he research aim ed to provide basis for the industrialized production of ch ondroitin sulfate.M eth odW ith the cartilage of chicken breast as raw m aterial ,the significant factors that affected the yield of ch ondroitin sulfate were studied in single factor optim ization test.And the opt

4、imum processing conditions of extracting ch ondroitin sulfate by lye hydrolysis m eth od were discussed.Result T he m aterial 2liquid ratio ,extraction tem perature and lye concn.had greater effects on the yield of ch ondroitin sulfate.T he m aterial 2liquid ratio was the m ost significant factor th

5、at affected the yield of ch ondroitin sulfate ,extraction tem perature was the sub 2significant factor and lye concn.was als o was one significant factor that affected the yield.T he op 2timum processing conditions of extracting ch ondroitin sulfate by lye hydrolysis m eth od were as follows :the m

6、aterial 2liquid ratio was 16.75,the reaction tem perature was 40and lye concn.was 6%.C onclusionUnder these conditions ,the highest yield of the obtained products of ch ondroitin sulfate was 19.75%,the purity was 82.59%and nitrogen content was 3.35%,which accorded w ith national standards.K ey w ord

7、s Ch ondroitin sulfate ;S ingle factor optim ization ;Y ield作者简介陈红丽(1979-,女,河南封丘人,助教,从事生物化工研究。3通讯作者,博士,副教授。收稿日期2008202219硫酸软骨素(Ch ondroitin sulfate 别名牛磺软骨素、康得宁等,是哺乳动物结缔组织的主要成分之一,多分布于软骨、鼻骨、喉骨、韧带、肌膜中。硫酸软骨素含有5070个双糖基本结构,分子量为1000050000。按其化学组成和结构,可分为CS A 、C 、D 、E 、F 、H 等多种同分异构体,药用硫酸软骨素是从动物软骨中提取的,主要是A 、C

8、及各种硫酸软骨素的混合物。CS A 和CSC 均由D 2氨基葡萄糖醛酸和N 2乙酰2D 2氨基半乳糖组成,只是硫酸基团位置不同1。随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果2-4,但应用于生产实际还有许多需要改进和完善之处,尤其是硫酸软骨素不同组分的分离技术还有待深入研究。笔者主要考察了提取硫酸软骨素过程中对产率的影响因素,旨在为工业化生产提供科学依据。1材料与方法1.1原料鸡胸软骨。1.2试剂盐酸(分析纯;无水乙醇(分析纯;丙酮(分析纯;氢氧化钠(分析纯;胃蛋白酶;胰蛋白酶(S igema ;活性炭;高岭土。1.3仪器U

9、V 22450紫外可见分光光度计;PHS 225精密pH计;DZK W 电热恒温水浴锅;10121干燥箱;JA2002电子天平;DDY 25全自动定氮仪;IR200傅立叶红外光谱分析仪;FW 2400A 倾斜式高速万能粉碎机。1.4反应原理由提取工艺条件筛选及优化试验结果5可知:影响硫酸软骨素产率的显著性因素很多,且影响的程度又各不相同。为了合理选择反应条件,笔者对碱液水解阶段的显著性因素进行了单因素优化试验。1.5工艺流程见图1 。图1硫酸软骨素撮工艺流程Fig.1P rocess flow o f chondroitin su lfate extraction2结果与分析根据前期研究结果5

10、可知,料液比、提取温度、碱液浓度对硫酸软骨素的产率影响较大、分别对这3个因素做单因素优化实验。2.1最佳料液比的选择料液比为影响硫酸软骨素产率的最显著因素,在16.00时硫酸软骨素产率最高。根据单因素优化试验选取原则,笔者选取料液比:15.50、15.75、16.00、16.25、16.50、16.75、17.00、17.258个水平进行试验,结果见表1。表1料液比单因素优化实验结果%T ab le 1T est resu lt o f single factor optimization o f solid 2liquid ratio料液比S olid 2liquid ratio硫酸软骨素C

11、h ondroitin sulfate产率Production rate 纯度Purity氮含量N content 15.5016.4873.24 3.0215.7516.4973.66 3.3616.0016.5161.75 3.7316.2516.6458.54 3.9416.5017.5156.82 4.0316.7521.4273.66 3.4917.0018.2377.15 3.4517.2515.7182.283.45由表1可知:料液比对产品产量的影响变化非常明显,硫酸软骨素产量随着料液比的增大而呈上升趋势,在料液比安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.

12、2008,36(15:6165-6166责任编辑金琼琼责任校对卢瑶为1(6.256.75区域内,急速上升,在料液比为16.75时最高,随后又呈急速下降趋势;硫酸软骨素纯度的整体趋势是先降后升,在1(5.506.50区域内呈下降趋势,从16.75处开始上升。但是在碱解部分,碱液主要是破坏硫酸软骨素与蛋白质之间的键,使硫酸软骨素释放出来,而对硫酸软骨素的纯度影响不大,所以主要是考虑产率的提高。综合考虑收率和纯度2项指标,选取料液比为16.75时为最优的单因素,此时硫酸软骨素的产率达到21.42%,纯度达到73.66%,氮含量达到3.49%,符合国家标准。2.2最佳碱解温度的选取碱解时提取温度为影响

13、硫酸软骨素产率的次显著因素,提取温度为40时产率最高。根据单因素优化试验选取原则,笔者选取36、38、40、42、44共5个水平进行优化试验,结果见表2。表2碱解温度单因素优化实验结果T ab le2T est resu lt o f single factor optimization o f alk ali2degrad ab le tem2 perature碱解温度Alkali2degradable tem perature硫酸软骨素Ch ondroitin sulfate产率%Y ield纯度%Purity氮含量%N content3616.0880.22 3.233817.1381.

14、25 3.634018.0682.18 3.514216.0374.27 3.694415.8472.83 3.77由表2可以看出:硫酸软骨素产率和纯度的趋势几乎一样,都是先上升,在达到一个最大值时,又下降,在40最大,在这个条件下的氮含量也达到了国家标准。说明碱液提取时,温度不仅影响产品的产率,还对产品的纯度影响较大。因此,选取40为最优的碱解温度,此时硫酸软骨素的产率达到18.06%,纯度达到82.18%,氮含量达到3.51%,符合国家标准。2.3最佳碱液浓度的选取碱液浓度为影响硫酸软骨素产率的显著因素,碱液浓度在5%时产率最高。根据单因素优化试验选取原则,笔者选取3%、4%、5%、6%、

15、7%、8%这6个水平进行优化试验,结果见表3。表3碱液浓度单因素优化实验结果%T ab le2T est resu lt o f single factor optimization o f lye concentration碱液浓度Lye concentration硫酸软骨素Ch ondroitin sulfate产率Production rate纯度Purity氮含量N content319.2560.93 3.78420.0670.19 3.81520.0380.22 3.32619.7582.59 3.35720.6775.92 3.51820.6169.14 3.42由表3可以得出:

16、硫酸软骨素产率随着碱液浓度的升高几乎一直呈上升趋势,碱液浓度在7%时硫酸软骨素产率最高,但是在浓度为8%时,产率略有下降。硫酸软骨素纯度随着浓度的升高也呈上升趋势,在6%时达到最高,随后又下降。由于碱解水解主要是分离提取硫酸软骨素,酶解主要是水解杂蛋白质,故综合考虑产率和纯度2项指标,选取6%为最佳的碱液浓度。2.4沉淀剂的选择在操作过程中,乙醇的加入改变溶液的极性,导致黏多糖溶解度的下降(黏多糖溶液的浓度以10%15%为最佳。温度越低沉淀速度越快,结晶越疏散,乙醇的用量也大大减少。在用无水乙醇沉淀时,无水乙醇的加入要按先慢后快、搅拌速度要先快后慢的原则,能使产品呈较疏松的白色粉末状。2.5结

17、构验证在碱液水解部分, 所得硫酸软骨素样品和标准品(S igma的红外光谱分析图见图1、2。2个红外光谱图相似,均在3400 (-OH,存在多糖羟基、1620(存在羧基、1560(C2N,存在乙酰氨基、1240及860cm-1(存在硫酸基有特征吸收峰。图1提取硫酸软骨素产品光谱Fig.1Spectrogram o f extracting products o f chondroitin su lfate图2硫酸软骨素标准品光谱Fig.2Spectrogram o f chondroitin su lfate stand ard3小结采用碱解-酶解相结合的方法,提取硫酸软骨素的质量较好。通过单因素优化试验,硫酸软骨素的产率有了较大的提高,同时得出用碱液水解的最佳工艺条件,即料液比为16.75,碱解温度为40,碱液浓度为6%。在该条件下,所得产品最高产率为19.75%,纯