免疫共沉淀详细顺序

1、免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋 白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beadsI 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到 精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定 I二I、/ 一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋 白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为

2、的影响；（3）可以分离得到天 然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白 质-蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者7i 在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验试剂 I.RIPABuffer配制： 基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） 精心整理 NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用修0配制成10%储存液；

3、避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使 酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4） （/1PX，.I 亮抑酶肽（Leupeptin）（用叱0配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存） .1I,” Z-_I/ 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存） RIPA磷酸

4、（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用O配制成200mM的储存液，见 SodiumOrthovanadateActivationProtoco） NaF（200mM的储存液，室温保存）7i 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂 2.工作液配制： 配制100ml的modifiedRIPAbuffer: 1）称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解，用HCl调节PH值至U7.4 2）加10ml10%的NP-40 3）加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4）加1m1100mM的EDTA,用量筒定容到1

5、00ml,2-8C保存5）理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100gPMSF,Na3VO4,NaF各500p），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： Tris-HCl:50mM,pH7.4 NP-40:1% 去氧胆酸钠：0.25% NaCl:150mM EDTA:1mM 4VrI PMSF:1mM 1 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1pg/ml Na3VO4：1mM NaF:1mM I 实验步骤 J- 准备工作：

6、 j1 预冷PBS,RIPABuffer,细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1 .用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS; 2 .加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）； 3 .用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4C, 缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；精心整理 4.4C,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中； 5.准备ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制

7、成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠； 6.每1ml总蛋白中加入100IProtein蹶脂糖珠（50%）,4c摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景； 7.4C,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子； I 8 .（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1:10倍以（/1P%I 上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20C保存一个月）； 9 .用PBS将总蛋白稀释到约1pg/以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白I/t,/ 在

8、细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10wg/61; 10 .加入一定体积的兔抗到500总蛋白中， 抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异； 11 .4C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h 室温孵育； 7j 12 .加入100林lProtein蹶脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4c缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2HlM渡抗体（兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG）; 13 .14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800区遍，RIPAbuffer有时候会破

9、坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物 内部的结合，可以使用PBS; 14 .用60wl2上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量 依据上样多少白需要而定（60口足够上三道）；15 .将上样样品煮5min,以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼 脂糖珠，上清也可以暂时冻-20C,留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。 实验流程为： 1 .转染后24-48h可收获细胞， 加入适量细胞裂解缓冲液 （含蛋白酶抑制剂） ， 冰上裂解30min,细胞裂解液于4Q最大转速离心30min后取上清； 2 .取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1区g相应的抗体加入

10、到细胞裂 解液，4。C缓慢摇晃孵育过夜； （/1PX，.I 3 .取10PIprotein礴脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min; 4 .将预处理过的10wlproteinA脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4 C .一JJ- 1Z-_I./ 缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连； 5.免疫沉淀反应后，在4 C以3,000rpm速度离心3min,将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15口的2XSDS上样缓冲液，沸水煮5分钟； 6.SDS-PAGE,Westernblotting或质谱仪分析。通

11、过免疫共沉淀确定结合蛋白 1）用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2）将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4c以最大速度离心 1 15min。 3）收集上清（约30ml）并加入30Hg的适当抗体，4c摇动免疫沉淀物1h。 4）加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4c摇动免疫沉淀物30min。 5）用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物， 再重复洗5次。 最后， 用NETN洗一次。 6）吸出混合物的液体部分。加入800w的1XSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min

12、 7）将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。 8）通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9）从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙睛洗两次，每次3min。10）用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。 11）通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自 动Edman降解测序。 注意事项 1 .细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS）,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2 .使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 3 .使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗