丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染的电镜研究

1、    丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染的电镜研究        【摘要】目的以常规电镜和免疫电镜技术，发现和证实慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)内丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。试在病毒形态学和形态发生学上证实PBMCs的HCV感染和复制。方法以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学方法，分别检测28例患者PBMCs内HCV RNA和HCVAg，对其中阳性标本重点进行电镜研究。结果HCV RNA和HCV Ag阳性检出率分别为77.27%(17/22

2、)和75.00%(21/28)，其中10例HCV Ag强阳性PBMCs的胞质空泡内发现直径分别约为65nm和110nm圆球形病毒颗粒，并可见病毒芽生形成现象。免疫电镜证实病毒颗粒及含病毒颗粒的空泡膜含HCV抗原性，确认所见为HCV颗粒。患者PBMCs显示核变形固缩和核/浆比例增大等超微结构改变。结论电镜及免疫电镜研究发现和证实了丙型肝炎患者PBMCs内复制的HCV样颗粒。从病毒形态及形态发生上证实患者PBMCs的HCV感染和复制。病毒在感染细胞胞质空泡部位合成和组装，以芽生方式进入胞质空泡内形成病毒颗粒。患者PBMCs显示核/浆比例增大，核变形和固缩等超微结构改变。【主题词】肝炎病毒，丙型；

3、白细胞，单核； 显微镜检查，电子； 免疫组织化学； 聚合酶链反应 Identification and visualzation of virus-like particles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with chronic hepatitis CCHEN Liangbiao, CHEN Peilan, TIAN Huiying, et al.（Institute of Liver Disease of PLA, Beijing Army General Hospital, Beijing 10070

4、0, China）【Abstract】ObjectivePBMCs from patients with chronic hepatitis C were examined by electron microscopy(EM), immune EM(IEM) combined with immunohistochemistry to trace the infection and morphology of HCV in the PBMCs. MethodsThe PBMCs from 28 patients with chronic hepatitis C were analyzed fir

5、stly for HCV RNA and HCV antigens by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. The PBMCs with positive HCV RNA and HCV antigens were then observed by electron microscopy. ResultsThe positive rate of HCV RNA and HCV antigens were 77.27%(17/22) and 75.00%(21/28) respectively. Two types of polymorp

6、hic HCV-like particles with diameter of approximately 65 nm and 110 nm were observed in cytoplasmic vesicles of the PBMCs from HCV Ag positive patients. 10 patients with HCV Ag over expression were studied by electron microscopy and immune election microscopy. The budding phenomenon of the particles

7、 could be also visualized in the cytoplasmic vesicles of the PBMCs. Some ultrastructural changes showed an increased ratio of cytoplasm to nucleus and pyknosis of nucleus was also suggestive of the virus infection. ConclusionThe EM study demonstrated the infection and replication of HCV in the PBMCs

8、 of chronic hepatitis C patients by morphology and morphogenesis.【Key words】Hepatitis C virus; Leukocytes,mononuclear; Microscopy,electron； Immunohistochemistry; Polymerase chain reaction丙型肝炎病毒(HCV)能否感染患者外周血单个核细胞(PBMCs)并在其中复制，是当前丙型肝炎研究中重要且有争议的问题1。本研究以RT-PCR和免疫组化技术分别检测28例慢性丙型肝炎患者PBMCs内的HCV RNA和HCVAg(

9、HCV抗原)，对其中阳性标本重点进行常规和免疫电镜研究，发现和证实了感染细胞内复制的HCV样颗粒。从病毒形态及形态发生上证实了患者PBMCs的HCV感染和复制。1材料和方法慢性丙型肝炎患者28例，血清抗HCV和HCV RNA均阳性，HBV标记均阴性，丙氨酸转氨酶持续异常(40 U/L以上)，均有临床表现，病程持续半年以上，80%以上病例有输血或注射血制品病史。健康献血员16例做对照研究。以上研究对象分别取静脉肝素抗凝血35 ml，以淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产)分离PBMCs。为排除血清中HCV对PBMCs的可能污染，按文献2方法以蛋白酶和RNA酶分别处理分离的PBMCs，然后以RT-PCR

10、和SP免疫组化法分别检测HCV RNA和HCVAg。其中阳性标本重点进行电镜和免疫电镜研究。免疫组化标本制备时，细胞悬液稀释成1×106/ml左右，以细胞离心法3贴附于载片上，空气干燥后甲醇固定10 min，-30保存备用。染色时第一抗体为抗HCV NS3和HCV核心区抗原的单克隆抗体，混合后应用。以上单抗分别由中国预防医学科学院病毒所詹美云教授，北京医科大学肝病研究所高建恩教授和军事医学科学院流行病微生物研究所录好英教授惠赠。SP免疫组化通用型试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术公司。HCV RT-PCR检测试剂盒购自北京京师生物技术公司。HCV RNA和HCVAg

11、检测均按试剂盒说明书步骤进行，一抗工作浓度1501100。常规透射电镜标本按常规方法制备，1nm切片定位后超薄切片，铀铅双染色后以JEM-1200EX透射电镜观察、照相和病毒颗粒大小测量。免疫电镜标本制备时，离心沉淀细胞层以PLP免疫电镜固定液固定1 h后，基本按SP免疫组化染色步骤进行，DAB显色后以3%戊二醛和1%饿酸双固定，然后按常规电镜方法制备标本，但超薄切片标本无须铀铅双染色即进行观察。由于免疫电镜标本制备时使用标记链霉卵白素的辣根酶(相当酶标第二抗体)，经其底物DAB显色后的产物，光学显微镜下呈棕黄色，显示HCVAg在细胞内阳性部位，而该产物在电镜下则为电子致密物，因此，电镜下电子

12、致密物标记的细胞内部位，即为病毒颗粒或病毒抗原的存在部位。2结果对28例中22例PBMCs进行了HCV RNA的RT-PCR检测，其中17例(77.27%)阳性。28例中HCVAg免疫组化检测阳性21例(75.00%)，阳性产物主要定位于胞质，其次是胞膜(版A，1)。此外，部分单核细胞胞核亦显示HCVAg阳性(版A，2)。献血员PBMCs的HCV RNA和HCVAg检测，以及以PBS缓冲液取替一抗的原HCVAg阳性片染色均显示阴性。对全部病例PBMCs进行了电镜观察，结果，在10例HCVAg强阳性PBMCs标本中均发现形态结构均一致的病毒颗粒。这些病毒颗粒呈圆球形，具有双层外膜结构，定位于胞质

13、空泡或内质网池内(1-1)。一个空泡内多见210个病毒颗粒，有时可达数十个。据形态结构及大小，病毒分两型，型直径6070 nm，平均65 nm，有空心和实心两种，前者占大多数；型直径100120 nm，内含直径65 nm核心，亦具有双层外膜结构(1-2)，此型病毒很少见。此外，含病毒颗粒的空泡内不难见到病毒芽生现象(1-3)，某些病毒颗粒与空泡膜相连，空泡膜的某些部位缺失(1-4)。患者PBMCs部分显示超微结构改变，主要表现为浆/核比例增大，细胞器较丰富，微绒毛增多，细胞核变形和固缩(1-5)，部分细胞胞质内可见多种形态的溶酶体和包含体。由于部分细胞胞核不规则，部分胞质凹入胞核内形成核袋，而

14、核袋内不难见到病毒颗粒(1-6)。经充分的电镜观察，PBMCs核内未见病毒颗粒。     1-1：胞质空泡内型空心圆球形病毒，具有双层外膜，空泡内尚可见少量不定形物质(?)；1-2：胞质空泡内型病毒颗粒和型实心病毒颗粒()；1-3：病毒向空泡内芽生()，胞质内游离核糖体丰富，M：线粒体；1-4：胞质空泡内型病毒颗粒，有的与空泡膜相连()，部分空泡膜缺失()；1-5：细胞核变形和固缩；1-6：核袋内病毒颗粒()，M：线粒体，N：胞核；标尺=100 nm1患者PBMCs常规电镜照片Fig.1Conventional EM observation of HCV

15、 particles in the PBMCs of the patientsFig.1-1:The HCV particles with 65 nm in diameter (type ) located in the cytoplasmic vesicles. Fig.1-2:The 65 nm and 110 nm (type ) particles in the vesicles. Fig.1-3:Budding of the particles() in the vesicles. Fig.1-4:The outer membrane of some particles() were

16、 connected to the membrane of the vesicles, A part of the vesicle membrane was lost(). Fig.1-5:Deformation and pyknosis of nucleus in the PBMCs. Fig.1-6: The HCV particles in the “nucleus-bag”() of the PBMCs Bar=100 nm    A患者PBMCS免疫组化。HCV NS3和HCV core蛋白抗原阳性，棕黄色产物定位于胞浆（）和胞膜（）（A1）；

17、部分单核细胞核亦呈阳性反应（）（A2）SP法，×400Fig.A Immunohistochemical localization of HCV core and N53 proteins in the PBMCS of the patients.HCV antigens located within the cytoplasm()and on cytoplasmic membrane ()(A1)but rarely in the nucleus (A2)of the PBMCs.SP method,original magnifiction ×400酶标免疫电镜标本显示

18、，空泡内病毒颗粒和含病毒颗粒的空泡膜和空泡内不定形物质电子密度增高(2)，表明空泡膜存在病毒抗原，空泡内病毒颗粒及不定形的病毒抗原为酶标产物特异标记。     2-1：胞质空泡膜()及空泡内病毒()为高密度酶产物特异标记；2-2：近细胞表面空泡膜()及空泡内病毒()为酶产物特异标记，部分空泡膜已破裂，N：胞核，M：线粒体；标尺=100 nm2患者PBMCs辣根过氧化酶免疫电镜照片Fig.2Immunoelectron microscopy of the HCV core and NS3 proteins in the PBMCs of the patie

19、nts Electron-dense reacting products indicating the site of HCV antigens coated on the HCV particles() and the vesicles membrane(). Bar=100 nm3讨论我们的免疫组化和RT-PCR检测研究结果表明，在70%75%慢性丙型肝炎患者PBMCs中检出HCVAg和HCV RNA，与国外PCR检测阳性率结果一致4，比原位杂交检测阳性率结果稍高5，表明患者PBMCs可能受HCV感染。然而，HCV能否感染患者PBMCs并在其中复制，仍是当前丙型病毒性肝炎研究中重要且有争议

20、的问题。我们在对慢性丙型肝炎患者PBMCs的PCR和免疫组化检测基础上，对强阳性病例标本重点进行了常规和免疫电镜研究。结果，在10例HCVAg强阳性PBMCs标本中发现了形态结构均一致的病毒颗粒。病毒颗粒呈圆球形，有双层外膜，定位于胞质空泡或内质网池内，大小形态均一，具有病毒结构特征，且不难观察到显示病毒复制形态特征的病毒芽生现象。据所见病毒形态结构分析，直径65 nm的型颗粒可能为型完整病毒的核心颗粒，相当于乙型肝炎病毒Dane颗粒的核心抗原颗粒；而直径100120 nm，内含65 nm核心的型颗粒可能为完整病毒。这些结果与1994年日本学者Kaito等6报告应用胶体金免疫电镜技术检测证实的

21、患者血中HCV颗粒形态结构相符，与我们在患者肝细胞内所见HCV样颗粒形态大小和定位一致7，与一些作者报告体外培养细胞内所见病毒样颗粒定位和大小相似8，9。而作为对照研究的16例献血员PBMCs，上述检查均阴性，电镜下均未见到此类病毒颗粒和超微结构改变，HCVAg染色阴性标本，电镜下亦未见到类似病毒颗粒。因此有理由推测，患者PBMCs内所见可能为HCV颗粒。为证实这一结论，我们进行了以抗HCV为一抗的辣根酶标免疫电镜研究，结果显示，感染细胞胞质内病毒颗粒及含病毒的空泡膜或内质网膜均为标记酶产物特异标记，证明含有HCV抗原性，进一步证实所见确为HCV颗粒，为HCV感染患者的PBMCs并在其中复制，

22、提供了形态学和免疫学与形态学结合的证据，同时也充分证明了HCV的肝外感染和复制对丙型肝炎的预防、诊断、药物疗效的判断和预测，以及慢性化机理研究等均有重要意义。免疫组化染色结果表明：病毒抗原存在于胞质内，这与电镜研究结果一致，电镜观察显示，病毒在感染细胞胞质空泡和内质网部位复制和组装，病毒芽生时携带空泡或内质网的双层膜结构进入空泡或内质网池内，形成完整病毒的核心颗粒。至于完整病毒如何形成和组装，尚待进一步观察研究。电镜观察还显示，患者部分PBMCs胞核常不规则，部分胞质常凹入胞核内形成核袋，而核袋内又不难见到病毒颗粒，这可能是造成光镜下细胞核区免疫组化HCVAg阳性着色的原因，并不表明HCV存在

23、于细胞核内或在核内复制。至谢：本研究得到本所姚鹏医师和本院化验科陈春艳技师支持基金项目：北京军区总医院医药卫生科研基金资助(95B013)作者单位：陈良标（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）陈佩兰（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）田惠英（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）刘超英（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）李琳（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）安萍（100700北京，北京军区总医院解放军肝病研究所电镜室）参考文献1，雷学忠.丙型肝炎病毒RNA在人外周血白细胞中的存在及其意义.

24、国外医学病毒学分册，1996，4：103-107.2，Willems M, Peerlink K, Mozhage H, et al. Hepatitis C virus-RNAs in plasma and in peripheral blood mononuclear cells of hemophiliacs with chronic hepatitis C: Evidence for viral replication in peripheral blood mononuclear cells. J Med Virol, 1994，42:272-278.3，Sansonno D, Ia

25、cobelli AR, cornacchiulo V, et al. Detection of hepatitis C virus (HCV) proteins by immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by nonisotopic in situ hybridization in bone marrow and peripheral blood mononuclear cells of chronically HCV-infected patients. Clin Exp Immunol, 1996，103:414-421.4，Saleh MG, Tibbs CJ, Koskinas J, et al. Hepatic and extrahepatic hepati