辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制

1、辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制         10-09-08 10:01:00     编辑：studa20                   作者：杨捷 冯玉麟 耿艳鸣 乔云飞 【摘要】  目的 观察具有抗炎活性的辛伐他汀对脂多糖 (LPS) 诱导的肺泡上皮细胞A549

2、黏蛋白表达的影响并探讨其机制。方法 用不同浓度的辛伐他汀作用于培养的A549细胞，采用定量RTPCR、ELISA和明胶酶谱法分别检测细胞的黏蛋白MUC5AC mRNA表达水平、MUC5AC蛋白含量及细胞上清基质金属蛋白酶 (MMP)9活性。结果 辛伐他汀组细胞中MUC5AC蛋白含量及MUC5AC mRNA水平较脂多糖组均明显下降(P<0.05)， 且浓度越高，作用越强。在正常情况下A549细胞培养上清液中几乎检测不到MMP9活性，而LPS作用后上清中MMP9活性明显增强(P<0.01)，预先给予不同浓度辛伐他汀孵育细胞培养上清液MMP9活性显著下降(P<0.05)。结论 LP

3、S诱导的A549细胞黏蛋白MUC5AC在mRNA和蛋白水平的升高与MMP9活性增强有关,而辛伐他汀可减少LPS诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达，且呈浓度依赖性,提示其作用可能与抑制MMP9活性有关。 【关键词】  辛伐他汀;脂多糖;黏蛋白;肺泡上皮细胞黏液高分泌是包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等在内的慢性气道炎症性疾病重要病理生理特征。过度分泌的黏液因其可加重气流阻塞并作为细菌定植和生长的培养基，导致抗生素效能下降，而成为影响疾病死亡率的一项独立危险因素1。细菌感染可促进黏液高分泌，即临床所说的痰液增多，甚至痰栓形成，其中革兰阴性杆菌的重要毒力因子脂多糖(LPS)是强效

4、促黏液分泌剂。在本研究中，体外黏液高分泌模型的建立是通过LPS刺激具有表达黏蛋白能力的肺泡上皮细胞A549。气道黏液的黏弹性主要取决于由黏膜下腺体的黏液腺细胞和气道上皮的杯状细胞合成的高度糖苷化蛋白质的黏蛋白(MUC)。现已证实MUC5AC是慢性炎症时呼吸道黏液所呈现的主要MUC表型2。研究表明，他汀类降脂药具有抗炎作用，并对病毒性肝炎、肾炎等疾病具有治疗作用。本研究通过LPS诱导A549细胞建立体外黏液分泌模型，旨在初步探索辛伐他汀对气道黏液分泌的影响及机制。1 材料与方法1.1 材料 肺泡上皮细胞株A549由本实验室保存。辛伐他汀购自杭州默沙东制药公司;LPS、明胶、噻唑蓝 (MTT)、T

5、ripure购自美国Sigma公司;胰蛋白、RPMI1640购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;小鼠MUC5AC单克隆抗体购自Chemicon公司;基质金属蛋白酶明胶酶谱法电泳分析试剂盒为上海GeneMed Scientifics公司产品;TaqDNA聚合酶为美国Promega公司产品;PCR试剂盒为大连宝生物工程公司产品;cDNA第一条链合成试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。1.2 细胞培养 A549细胞常规培养于含10%灭活的胎牛血清，并加入1%L谷氨酰胺及1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中，放置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育;当细胞融合达70%9

6、0%时，换用无血清培养基继续培养24 h。1.3 药物处理3 辛伐他汀按16 mg/ml溶于0.06 mol/L NaOH和40%乙醇，于50加热2 h，用HCl调整溶液pH至7.2，加入等体积的蒸馏水，使其浓度为40 mol/L，冻存于-20备用。采用MTT比色法检测实验浓度辛伐他汀对细胞活力影响，酶联免疫检测仪于570 nm波长测定各孔吸光度值(A)。计算细胞活力：细胞存活率=实验组A值/阴性对照组A值×100%，每实验组设8个复孔，取均值。1.4 分组 细胞随机分为对照组 (无血清培养基培养)、LPS组(无血清培养基中加入10 g/ml LPS)、辛伐他汀组 (无血清培养基中加

7、入30 mol/L辛伐他汀)、LPS+20 mol/L辛伐他汀组 (先于无血清培养基中加入20 mol/L辛伐他汀孵育30 min后，再给予同样浓度LPS)、LPS+30 mol/L辛伐他汀组 (先于无血清培养基中加入30 mol/L辛伐他汀孵育30 min后，再给予同浓度LPS)，各组均培养24 h后行指标检测。1.5 荧光定量RTPCR检测细胞MUC5AC mRNA表达 提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA，再行定量PCR。引物由上海Genebase生物公司合成。MUC5AC上游引物序列为5TCCTTCTTGTCAATGGTGTCT3;下游为5ACCAGGTTCAGGACAAGTAG3;G

8、APDH上游引物序列为5CCTCAAGATTGTCAGCAAT3;下游为5CCATCCACAGTCTTCTGAGT3。根据目的基因MUC5AC与管家基因GAPDH的标准曲线，将提取的RNA样品进行定量，PCR反应条件是预变性：94×2 min;再94 25 s，50 30 s，72 40 s共40个循环;最后72 延伸5 min。将检测荧光强度的时相设定在扩增反应的退火期 (50 30 s)，读取样品扩增达到所设阈值的反应循环数Ct值，Ct=Ct(目的基因待测样品GADPH待测样品)Ct(校正样品GADPH校正样品)，计算得到MUC5AC相对于GAPDH的定量。1.6 ELISA法检

9、测细胞裂解上清液中MUC5AC蛋白含量 提取细胞内蛋白，行总蛋白定量，取各组样本测定总蛋白量后用裂解液调整蛋白浓度使各样本一致，并用0.01% PBS稀释蛋白样本。采用ELISA方法测定MUC5AC蛋白含量。1.7 明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶9(MMP9)活性 收集各组细胞上清液，于4，2 000 r/min，离心5 min去细胞碎片，将上清置于70冻存备用。吸取10 l条件培养液于1.5 ml EP管，加入上样液，混匀，室温下静置10 min;取20 l样品于含明胶的10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12 h，置已完成的凝胶于10 ml 2.5% TritonX100溶液中浸泡低

10、速振摇1 h，于明胶酶缓冲液中37孵育1824 h，用0.5%考马斯亮蓝染色，加入10%乙酸、40%甲醇混匀，脱色至白色条带与蓝色背景对比清晰即可。凝胶扫描、照相、使用Scion Image 4.0.2图像分析软件测定白色条带的光密度值(OD)，计算各组MMP9相对活性。1.8 统计学处理 数据均以x±s表示，使用统计分析软件SPSS 10.0进行数据分析，两两比较采用方差分析。2 结 果2.1 辛伐他汀对A549细胞MUC5AC mRNA表达的影响 两种实验浓度的辛伐他汀对细胞活力影响小，电镜下观察细胞无明显改变，细胞贴壁能力好。无LPS刺激时A549细胞即有MUC5AC mRNA

11、的表达，而LPS刺激后细胞中MUC5AC mRNA的表达明显增加(P<0.01);在20和30 mol/L两种浓度辛伐他汀干预下，可使MUC5AC mRNA的表达明显降低(P<0.05)，且两组MUC5AC mRNA表达也存在显著性差异(P<0.05)，见表1。2.2 辛伐他汀对A549细胞MUC5AC蛋白表达的影响 LPS刺激后，细胞MUC5AC蛋白相对含量 (以MUC5AC/总蛋白表示) 较对照组明显升高(P<0.01);预先给予两种浓度辛伐他汀处理后再予LPS刺激，MUC5AC蛋白水平显著下降(P<0.05)，不同浓度辛伐他汀干预作用有差异(P<0.05)，见表1。2.3 辛伐他汀对A549细胞MMP9活性的影响 凝胶中的明胶能被MMP9分解，因此在考马斯亮蓝染色后，在蓝色背景下于92 kD分子量处出现白色负染色条带。正常情况下A549细胞在没有外界刺激下几乎不表达MMP9活性。LPS刺激后细胞上清液中MMP9活性明显增加(P<0.01);预先给予两种浓度辛伐他汀