ATRA诱导结肠癌细胞株LoVo分化与凋亡

1、    ATRA诱导结肠癌细胞株LoVo分化与凋亡        摘要：目的体外研究维甲类化合物的衍生物ATRA对LoVo结肠癌细胞株的作用。方法观察ATRA作用下LoVo细胞的增殖、细胞周期和凋亡。结果ATRA使细胞增殖抑制，细胞阻滞于G0/G1期，高浓度组出现亚“G0/G1”峰。ALP比值增高，高浓度组电镜下见凋亡细胞，TDT法测凋亡细胞比例增高，但传6代后不增加。结论提示ATRA可诱导LoVo细胞分化及凋亡，但有一定限度；实验结果为临床应用ATRA化学预防结肠癌提供理论

2、依据。关键词：结肠肿瘤；细胞周期；凋亡；维甲酸；肿瘤细胞，培养的分类号：R73-361文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)01-0004-04ALL-TRANS-RETINOIC ACID INDUCED DIFFERENTIATION AND APOPTOSIS OF COLORECTAL CANCER CELL LINE LoVoLU Ai-guo(Surgical Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)YU Bo-ming(Surgical

3、 Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)ZHENG Min-hua(Surgical Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)Abstract：ObjectiveThe potential roles of all-trans-retinoic acid (ATRA) in colorectal cancer cell line LoV

4、o in vitro were studied.MethodsThe proliferation, the cell cycle and the apoptosis of LoVo cells were determined after treated with ATRA.ResultsATRA could significantly inhibit proliferation of LoVo and greatly increase ALP of the cells in time-dependent manner.In cytometry analysis,LoVo cells lines

5、 accumulated in G1 phase and appeared an extra “sub-G0/G1 peak” when higher dosage of ATRA was presented.Apoptotic cells only in 10-5mol ATRA were found by electronic microscopy.ConclusionATRA could both induce differentiation and apoptosis of LoVo cells.This observation may become an indicator for

6、clinical trials on prevention of colorectal cancer.Key words：Colorectal neoplasms;Cell cycle;Apoptosis;Retinoic acid;Tumor cell,cultured维甲类化合物在机体生长、发育、分化和致癌过程中起着重要作用1，ATRA是维甲类化合物的衍生物，在许多细胞系的研究中发现具有抑制生长，诱导分化甚至凋亡作用13。在作者的研究中也发现ATRA有诱导结肠癌细胞株LoVo分化作用4，但是否存在凋亡及分化和凋亡的联系尚未见报道，我们就此作进一步研究。材料和方法一、材料LoVo细胞株取自结

7、肠癌转移淋巴结，由美国建株，从中国科学院细胞所购买。ATRA，上海第六制药厂产品，无水乙醇溶解除菌过滤，实验及对照组乙醇浓度均为0.05 %。MTT(氮兰四唑盐)，d-UPT,FITC,RNase，碱性磷酸酶试剂盒，末端转移酶购自Sigma公司。二、方法1.细胞培养LoVo细胞常规培养在含10 %小牛血清的RPMI 1640培养中，48 h换液1次，换液时均在弱光下进行。取对数生长期细胞进行实验。2.细胞计数及活性测定将10-6mol ATRA作用第6天及传4代的LoVo细胞用0.25 %的胰酶消化成单细胞悬液，台盼蓝排染法测细胞活力，并用TDT法测凋亡细胞比例。3.细胞增殖测定采用MTT法5

8、。细胞消化后培养在96孔板，每孔加细胞5×103。实验分1×10-5mol、1×10-6mol、1×10-7mol三组药物浓度和对照及空白对照5组，分别于加药后第2、4、6天进行MTT测定。测定值用吸光率A表示。按方差分析进行数据统计。生长抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)4.流式细胞仪(FCM)分析细胞周期分别在10-5、10-6mol ATRA作用下LoVo细胞于加药后第2、4、6天、传代2、4、6次后与对照组细胞进行FCM测定，采用单染色单激光法6。5.电镜下观测凋亡细胞LoVo细胞在1×10-5mol、

9、1×10-6mol ATRA作用6天后，同对照细胞用2% 戊二醛、锇酸固定，酒精逐级脱水、渗透、618-环氧树脂包埋、超薄切片、铀铅染色后在透射电镜下观察凋亡细胞。6.TDT法定量检测凋亡细胞将贴壁细胞消化成单细胞悬液，于沉淀细胞中加入含有1%甲醛的PBS 1 ml，30 min，加入0.5 g末端转移酶，0.5 nmol/L b-16 dUTP，37，30 min取出，PBS洗涤后加入生物素标记的FITC。室温避光30 min。荧光显微镜下呈荧光阳性细胞，计数200个肿瘤细胞，根据阳性细胞所占百分率的多少来判断ATRA对肿瘤细胞的凋亡作用。每次测定时间对照及处理组各3个标本，重复实

10、验2次。7.碱性磷酸酶比活性测定细胞消化离心后PBS洗涤3次，去上清液，加0.25 %脱氧胆酸钠0.5 ml，液氮冻存以备测。碱性磷酸酶测定用碱性磷酸酶试剂盒(包括基质缓冲液，终止液)采用磷酸苯二钠法。总蛋白测定采用紫外吸收法7。ALP比活性(IU/mg)=ALP值/总蛋白量结果一、MTT法测定细胞生长抑制MTT法测定反映活细胞量，通过比色方法测定吸光率了解细胞增殖情况。实验结果是ATRA对LoVo细胞有生长抑制作用，并呈时间依赖关系，最高抑制率达48.86 %，三组药物浓度与对照组比较在第6天时均有显著差异，提示在10-510-7mol间均为有效药物浓度(见表1)。表1MTT测细胞增殖(A值

11、)分组组数药物作用时间第2天第4天第6天10-5mol ATRA120.6890±0.07330.7951±0.0627*0.8727±0.0468*10-6mol ATRA120.6462±0.10200.8178±0.1001*0.9203±0.449*10-7 mol ATRA120.6918±0.7560.8206±0.0676*1.0271±0.0796*对照组120.7220±0.07891.0908±0.11051.5166±0.1268*P0.05?*P0.0

12、1 二、10-6mol ATRA 作用下第6天及传5代细胞其细胞活力均90 %，TDT测凋亡细胞比例未见增高，提示10-6 mol/L浓度并不促使细胞死亡。三、流式细胞仪测定细胞周期显示药物作用下，G0/G1期细胞比例明显增高，G2/M期+S期比例下降，10-5 mol组第6天及转代2、4、6代细胞周期又开始发生变化。G0/G1期比例逐渐下降，S期细胞比例逐渐上升，同时直方上第6天出现亚“G0/G1”峰，而10-6组传6代后直方上不出现“亚G0/G1”峰(见表2)。表2FCM测各期细胞比例(%)G0G1期S期G2+M期凋亡比例处理组对照组处理组对照组处理组对照组处理组对照组第2天A67.233

13、.422.237.810.628.89.688.47B63.533.418.537.81828.83.298.47第4天A78.341.14.440.417.318.59.542.58B65.741.113.740.420.618.53.842.58第6天A57.448.928.037.214.613.921.54.95B78.514.95传2代A42.546.145.338.712.115.321.232.9传4代A50.954.732.527.416.517.933.79.98传6代A48.351.338.123.513.625.327.22.5

14、0B74.051.315.823.510.325.38.682.50注：A为10-5 mol组；B为10-6 mol组 四、透射电镜发现10-5mol组有特征性的凋亡细胞，其染色质浓集，成新月形，核固缩，细胞膜完整，而10-6mol组及对照组未找到特征性凋亡细胞。五、TDT法可以定量测定凋亡细胞8，它是用生物素标记的d-TUP在末端转移酶的作用下标记到DNA的5端缺口上，再用亲和素标记的FITC与之结合使发生荧光，在荧光显微镜下即可观察。在10-5mol/L ATRA作用下凋亡细胞逐渐增多，呈时间依赖关系，但传4代以后凋亡细胞比例进入平台期。说明ATRA对LoVo细胞的凋亡作用有一定限度。10

15、-6mol组凋亡细胞比例未见明显增高，诱导细胞凋亡与药物浓度相关(见表3)。表3TDT测凋亡细胞比例(%)分组药物作用时间第2天第4天第6天传2代传4代传6代对照组6.67±0.5777±18.67±1.1556.67±1.1556.33±1.1558.33±0.577处理组*15.67±1.52821.67±3.21529.67±2.08234.67±2.51142.33±3.21539.67±2.517?处理组ATRA浓度为1×10-5mol/L 六、肠型ALP

16、是LoVo细胞成熟分化标志酶7，该酶为热不稳定酶。在实验中作者发现10-6mol/L ATRA作用下ALP比活性持续不断增高，存在时间依赖关系，而且早期即升高。测65温育后ALP值显著下降，表明ALP为热不稳定酶即肠型ALP，是LoVo细胞成熟分化的表现。10-5mol组在第6天及传4代后ALP比活性仍明显高于对照组，提示诱导分化也发生在高浓度组(见表4)。表4肠型ALP比活性测定(10-2 IU/mg)分组药物作用时间第2天第4天第6天传2代传4代传6代10-6组4.622±0.2766.394±0.2768.640±0.41610.81±0.4641

17、4.77±0.66523.09±0.81110-5组8.23±0.46512.61±0.896对照组3.19±0.2343.191±0.1593.231±0.2683.079±0.1783.280±0.1663.276±0.108讨论 分化和凋亡是肿瘤化学防治中的新思路，正越来越受到重视。诱导分化在治疗急性早幼粒白血病的成功确立了其在肿瘤防治中的地位9。在实体瘤中，诱导分化在肿瘤的化学预防，尤其是来自上皮的恶性肿瘤，包括预防第二原发癌中有广阔前景和潜在的意义1。凋亡近来更是成为研究热点，众多学者

18、认为肿瘤发生发展转归与凋亡的调控正常与否密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡即可达到治疗肿瘤目的10。众多实验中发现了许多诱导剂可诱导肿瘤细胞分化或凋亡，更让人高兴的是有些诱导剂既可诱导分化又能诱导凋亡。如活性D3诱导乳腺癌细胞分化和凋亡11，硒、5-FU诱导结肠癌细胞T29分化和凋亡12，13。维甲类许多制剂在众多肿瘤细胞系中显示明显的诱导分化和凋亡作用。如ATRA，CRA对乳腺癌细胞株2，4-HPR诱导胚胎瘤细胞F9，SLCC等14，15。在作者的实验中发现ATRA作用下肠型ALP增加，提示LoVo细胞成熟分化，在高浓度组，电镜下见典型凋亡细胞，流式细胞仪测定高浓度组出现“亚G0/G1凋亡峰”，TD

19、T法测凋亡细胞比例增加，有时间依赖关系，但传6代后凋亡细胞比例不增加，说明ATRA也能使大肠癌细胞分化和凋亡。凋亡的发生与细胞增殖分化的不同状态密切相关16。凋亡可以发生在细胞终末分化后，继而细胞死亡，在许多细胞系内终末分化等于死亡17。凋亡也可能和细胞分化同时发生，诱导剂诱导细胞正常分化，而不能分化的肿瘤细胞发生凋亡，这是诱导分化和凋亡防治肿瘤的理想方式。作者的实验发现10-6mol/L处理组ALP比活性持续升高，但凋亡细胞比例并不升高，药物诱导细胞分化但不诱导凋亡。10-5mol/L处理组ALP比活性升高且凋亡细胞比例也升高，提示凋亡与分化同时存在，但凋亡与分化是独立的两种方式，凋亡并不继

20、发于细胞终末分化而与诱导药物浓度相关，推测高浓度ATRA触发了诱发凋亡的启动点。目前也发现有些维甲酸衍生物诱导细胞凋亡并不伴有诱导分化，两者不相干，HPR诱导神经母细胞瘤凋亡即为典型例子18。也有发现诱导细胞凋亡取决于是否诱导成熟分化，诱导成熟分化时则不易诱导凋亡，而诱导凋亡则不能诱导成熟分化，诱导分化和凋亡经过一条共同信息通路，bcl-2蛋白在其中起调节作用19。就维甲类化合物在抗实体瘤作用来看，尽管一些新合成药物如HPR对NSLC，乳腺癌等体外有很强的诱导凋亡作用，但体内实验尚无满意效果，其他维甲类化合物包括ATRA诱导凋亡作用不强。作者的实验也发现诱导LoVo细胞株凋亡有一定限度而且发生

21、较迟，因此用于化学治疗难于取得满意效果，维甲酸在大肠癌上的意义主要在化学预防上。维甲酸的诱导分化和凋亡改变了传统化疗对正常和肿瘤组织格杀勿论的缺陷，为肿瘤治疗寻找新的靶点，值得深入研究。作者简介：陆爱国，男，硕士，主治医师。作者单位：陆爱国（上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海，200025）郁宝铭（上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海，200025）李东华（上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海，200025）崔巍（上海第二医科大学附属瑞金医院外科，上海，200025）参考文献：1Smith MA,Parkinson DR,Cheson BD,et al. Retinoids in ca

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