美天旎流式BMQPPT01TFH111212-translation

1、MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的基本原理MACSQuant Analyzer 流式细胞仪培训MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 日程日程 流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用 流式细胞仪参数的设置 数据的显示 数据分析: 逻辑设门, 排除设门, 统计MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 日程 流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用 流式细胞仪参数的设置 数据的显示 数据分析: 逻辑设门, 排除设门, 统

2、计MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy CYTOCellMeasurementMETRYFlow cytometry:什么是流式细胞仪?MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流式细胞仪能测什么？流式细胞仪能测什么？细胞大小细胞大小细胞细胞颗粒性颗粒性细胞表面标记和表型细胞表面标记和表型细胞计数细胞计数核酸核酸细胞器细胞器MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 散射光信号散射光信号: 细胞的固有参数细胞的固有参数(无需荧光探针标记无需荧光探针标记)细胞大小角度小的散射光=

3、前散射(FSC)细胞质的颗粒度角度大的散射光= 侧散射(SSC)细胞计数散射光或电阻可以检测的细胞参数可以检测的细胞参数MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 前向探测器检测到的散射光 (和激光束同轴的散射光) 前向角散射光信号的强弱与细胞大小有关前向角散射光信号前向角散射光信号(FSC) 检测的相关参数检测的相关参数细胞大小细胞大小MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 与激光束垂直的散射光信号称为侧向角散射光信号（侧向角散射光信号（SSC） SSC信号的强弱与细胞的颗粒度有关侧向角散射光信号侧向角散射光信号(S

4、SC) 检测细胞的颗粒性程度检测细胞的颗粒性程度MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 散射光信号可用于区分主要的细胞亚群散射光信号可用于区分主要的细胞亚群例如例如: 人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 散射光信号散射光信号: 内在的结构参数内在的结构参数 (不需要探针不需要探针)细胞大小细胞大小小角度光散射小角度光散射 = 前向角散射前向角散射 (FSC)细胞颗粒细胞颗粒性性 大角度光散射大角度光散射 = 侧向角散射侧向角散射 (SSC)荧光信号荧光信号: 外在的结构和功能

5、参数外在的结构和功能参数 (需荧光探针需荧光探针)表面受体表面受体 例例 ：标记抗体：标记抗体活性活性 例例 ：PI , 7-AADDNA/RNA 含量含量 例例 ：PI / AO 总蛋白总蛋白例：共价键或离子键的酸性结合染料例：共价键或离子键的酸性结合染料 脂肪脂肪 例例 ：Nile red凋亡凋亡 例例 ：Annexin V细胞内蛋白细胞内蛋白 例例 ：细胞因子，信号转导分子：细胞因子，信号转导分子 (标记抗体标记抗体)酶活性酶活性 例例 ：荧光底物：荧光底物 DNA 合成合成 例例 ： BrdU 染色（增殖染色（增殖)增殖增殖 例例 ： CFSE可测量的细胞参数可测量的细胞参数MACSQ

6、uant Analyzer TrainingMACS Academy ?什么是荧光什么是荧光MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 荧光的原理荧光的原理MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 荧光试剂的类型荧光试剂的类型 荧光探针 Nile red 检测脂肪含量 CFSE 标记所有蛋白; 检测细胞增殖 Propidium iodide 标记双链核酸; 用于检测细胞活性和DNA含量分析 荧光蛋白 耦联荧光染料的探针 Annexin 与凋亡和坏死细胞细胞膜表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合 可溶的配体 与细胞的相应受体结合 流

7、式抗体 基于抗原抗体的特异性结合，流式抗体可以和所有的特异性分子结合MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 耦联荧光素的探针检测相应的细胞参数耦联荧光素的探针检测相应的细胞参数MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 细胞内蛋白细胞内蛋白 细胞因子细胞因子, 酶, 骨架蛋白, 细胞信号分子, 转录因子, 核抗原, .细胞表面蛋白细胞表面蛋白 受体, 黏附分子, 配体, .流式抗体的检测范围流式抗体的检测范围:抗体标记抗体标记细胞固定细胞固定+ 破膜破膜免疫荧光标记免疫荧光标记MACSQuant Analyzer Tr

8、ainingMACS Academy VioBlue, FITC & APC的激发光的激发光(Ex)和发射光和发射光(Em)光谱光谱 relative absorbance & emissionEmEmEmExVioBlue ExFITCExAPCMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Analyzer的应用举例的应用举例 7 色的免疫分型死细胞，凋亡细胞的检测 PI, Annexin V胞内染色(细胞因子, 转录因子)细胞因子分泌检测细胞周期分析 PI, BrdU染色体分析微泡分析细胞计数钙离子内流 Fluo4检测R

9、OS(H2DCFDA) and NO (DAF-FM diacetate) 用CFSE or CMFDA检测细胞增殖报告荧光蛋白的检测 GFP, CYP, YFP, tdTomatoMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 总结总结: 可以检测的参数可以检测的参数MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 日程 流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用 流式细胞仪参数的设置流式细胞仪参数的设置 数据的显示 数据分析: 逻辑设门, 排除设门, 统计MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流

10、式细胞仪的主要构成系统流式细胞仪的主要构成系统: 液流系统液流系统 将颗粒带到检测点 光学系统光学系统 产生和收集光学信号 电子系统电子系统 完成光电信号的转换及信号处理MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 液流系统液流系统问题问题: 哪个信号是来自哪个细胞呢哪个信号是来自哪个细胞呢?MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 液流系统液流系统解决方案解决方案: 将细胞或其它生物微粒排成单列依次通过检测点将细胞或其它生物微粒排成单列依次通过检测点MACSQuant Analyzer TrainingMACS Acad

11、emy 高速高速 液流系统液流系统低速低速MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Analyzer的液流系统的液流系统 仪器前面仪器前面 进样针进样针 注射泵注射泵 (5ml, 0.5ml) 带有进样系统清洗工作站带有进样系统清洗工作站 压力感受器压力感受器 细胞富集系统细胞富集系统(分选分选) 柱柱MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Analyzer的液流系统的液流系统 仪器后面仪器后面 A 鞘液贮存器 B 鞘液滤器(过滤鞘液) 鞘液 & 空气压力泵(不可见)A

12、BMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Analyzer的独特功能 固定体积上样固定体积上样 进样针可以吸取预先设定好进样体积的样品 进样体积会全部被检测 可以自动计算 events / L或mL 每次检测都能进行绝对计数 无需计数微球 三种不同的进样速度25 / 50 / 100 L/min MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流式细胞仪的光学系统流式细胞仪的光学系统组成部分组成部分: 光源光源 光学滤片和双色性反射镜光学滤片和双色性反射镜 检测用的光电倍增管检测用的光电倍增管(PMT)

13、MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 激光输出的光是激光输出的光是: 单色光单色光 相干光相干光 (同相，相同频率同相，相同频率) 高密度高密度 单向性单向性光学系统光学系统: 光源光源- 激光激光MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 光学系统光学系统: MACSQuant Analyzer 的激光的激光 蓝激光蓝激光(氩离子氩离子) 488 nm25 mW 红色二极管激光器红色二极管激光器 635 nm20 mW 紫色二极管激光器紫色二极管激光器 405 nm40 mWMACSQuant Analyzer T

14、rainingMACS Academy 流式细胞仪如何检测激光信号流式细胞仪如何检测激光信号?MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 细胞发射出的多种光学信号（散射光和荧光信号）被不同细胞发射出的多种光学信号（散射光和荧光信号）被不同的的“通道通道”(FSC, SSC, V1, V2, B1,.) 捕获，同时被检测捕获，同时被检测 探测器的特异性可以收集光学滤镜和双色性反射镜的光探测器的特异性可以收集光学滤镜和双色性反射镜的光 检测荧光信号的探测器为光电倍增管检测荧光信号的探测器为光电倍增管(PMT)光学系统光学系统: 探测器探测器MACSQuant A

15、nalyzer TrainingMACS Academy 光学系统光学系统: 滤光片类型滤光片类型MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 光电倍增管光电倍增管(PMTs): 检测光子检测光子 转换光电信号转换光电信号 放大信号放大信号电子信号探测器电子信号探测器: 它们是它们是?MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy Sample uptake portMACSQuant Analyzer的光学设置的光学设置MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Anal

16、yzer 的光学通道的光学通道ExcitationChannelFilters Detection range nm405 nmV1450/50 425 - 475V2*525/50500 - 550488 nmB1525/50 500 - 550B2585/40 565 - 605B3655 (LP) +(730 LP DM)655 - 730B4750 (LP) 750 - 635 nmR1655 (LP) +(730 LP DM) 655 - 730R2750 (LP) 750 - 488 nmFSC/SSC488/10*MQ10 Only MACSQuant Analyzer Trai

17、ningMACS Academy VioBlue, FITC & APC的激发光和发射光光谱的激发光和发射光光谱405 nm488 nm635 nm450/50525/50655-730relative absorbance & emissionMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 电子系统电子系统 数据转换的界面数据转换的界面 将光学信号转化为相应比例放大的电信号将光学信号转化为相应比例放大的电信号 (电压脉电压脉冲冲) 分析电压脉冲的高度，面积或是宽度分析电压脉冲的高度，面积或是宽度MACSQuant Analyzer Traini

18、ngMACS Academy 面积面积 = 高度和宽度的积分高度和宽度的积分面积面积电子系统电子系统 利用利用PMT转换光学信号转换光学信号信号的强弱信号的强弱: 光子数量光子数量 PMT 电压电压 / 放大放大高度高度 = 信号的强度信号的强度高度高度宽度宽度 = 细胞的大小细胞的大小宽度宽度cellMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy ADC = Analog to Digital signal ConverterCompensationADCADCCompensation数字数字数字数字数字数字模拟模拟数字数字信号转换信号转换 模拟模拟数字数字模

19、拟模拟 数字信号的流式细胞仪数字信号的流式细胞仪模拟信号的流式细胞仪模拟信号的流式细胞仪MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 电脉冲信号的数字化电脉冲信号的数字化 相对荧光强度0 10101.1.01.00111010010000.16553665536566550.010 .0001MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 总结：液流系统，光学系统，电子系统总结：液流系统，光学系统，电子系统MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy MACSQuant Analyzer Tra

20、iningMACS Academy 日程 流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用 流式细胞仪参数的设置 数据的显示数据的显示 数据分析: 逻辑设门, 排除设门, 统计MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流式数据图流式数据图 单光学参数图单光学参数图 :直方图直方图 双光学参数图双光学参数图: 散点图散点图 密度图密度图MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 直方图直方图Event 1Event 2Event 3FSCSSCV13060500100160492300650505Event 4Event 5Event

21、675790507121322507297604507MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 细胞的荧光强度与标记的流式抗体量有关细胞的荧光强度与标记的流式抗体量有关MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy CD20 APC染色的染色的PBMC 直方图直方图CD20+CD20-CountsCD20 APCMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 0200400600 800 100002004006008001000V1B1Event 1Event 2Event 3FSCSSCV

22、1B1306063884010016024585300650160720400800084085245638V1B1020040060080010002006001000散点图散点图 2 维维MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 双参数分析双参数分析散点图散点图LLULLRURMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 散射光组合显示的散点图散射光组合显示的散点图FSCSSC单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞裂解后人的外周血裂解后人的外周血PBMC粒细胞粒细胞碎片碎片MACSQuant Analyzer Trainin

23、gMACS Academy 散射光信号散射光信号 排除小的细胞碎片排除小的细胞碎片Side ScatterForward ScatterSide ScatterForward Scatter碎片碎片73%碎片碎片6.5%裂解的外周血裂解的外周血Trigger / ThresholdMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 散点图和密度图散点图和密度图散点图散点图密度图密度图CD45CD34密度最高密度最高（红）（红）密度最低密度最低（蓝）（蓝）MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 脉冲信号转化脉冲信号转化 相对荧光

24、强度0 10101.1.01.00111010010000.16553665536566550.010 .0001MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 流式数据的显示标尺流式数据的显示标尺 Hloglog5log4MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 总结：数据的显示总结：数据的显示CD20+CD20-CountsCD20 APCMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 日程日程 流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用流式细胞仪可以检测的细胞参数和应用 流式细胞仪参数的设置流式

25、细胞仪参数的设置 数据的显示数据的显示 数据分析数据分析: 逻辑设门逻辑设门, 排除设门排除设门, 统计统计MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 设门的目的设门的目的 决定分析哪些目的细胞群决定分析哪些目的细胞群 排除不想要的颗粒排除不想要的颗粒(e.g. 死细胞死细胞) 选择和分析特定的细胞亚群选择和分析特定的细胞亚群MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 设门是具体分析某一细胞亚群的工具设门是具体分析某一细胞亚群的工具在戴眼镜的人群中有多少男性和多少女在戴眼镜的人群中有多少男性和多少女性？性？MACSQuan

26、t Analyzer TrainingMACS Academy 使用设门对多个细胞亚群进行分析使用设门对多个细胞亚群进行分析CD3CD45CD8CD4CD4CD45RAP1P2P1/P2P3P1/P2/P3P4P1/P2/P3/P4P5P6P1B2B3FSCSSCMACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy 亚群分析的统计值亚群分析的统计值 Mean - Median - Mode - CV - SD -MACSQuant Analyzer TrainingMACS Academy CD20 APC染色的染色的PBMC直方图直方图 区间区间 统计统计 frequencyintensityCD20+CD20-CountsCD20 APCRegion%-#%-TCD20-APC-A MeanCD20-APC-A MedianSrv2009-02-04_2062.052.