TLR4在脑出血继发性损伤中脑水肿形成的

1、脑出血后继发性损伤脑水肿形成是多种机制的综合结果，其中炎性损伤机制备受瞩目3,4，各种炎性细胞的激活，细胞因子、炎性递质的释放，共同造成或加重继发性脑损伤5。研究表明炎性反应与脑水肿有着密切联系：炎性反应是脑水肿形成的重要原因6,7。目前在炎症免疫反应的研究领域里，Toll 样受体家族（Toll-like Receptors, TLRs）是众多学者的关注热点，其属于跨膜信号转导受体家族，通过感知病原微生物存在，转导细胞的炎性信号，参与多细胞生命体古老的防御机制，是连接先天免疫和特异性免疫的纽带。TLR4参与脑缺血再灌注损伤已被实验所证16,17,18，TLR4激活炎性反应是缺血性卒中后脑水肿形

2、成的重要环节。Cao等16采用大鼠大脑中动脉线栓模型,研究发现脑缺血6h再灌注24h后,无论是脑水肿程度、脑梗死体积,还是神经元损伤程度, TLR4缺陷的小鼠都明显低于野生型,并且 TNF-和IL-6水平降低,认为脑缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通过抑制炎性细胞的激活,下调炎性细胞因子的产生来减少炎症反应,从而减轻损伤程度。其实脑出血后血肿周围也存在缺血现象19，出血性卒中与缺血性卒中的损伤机制在某种程度上有着共性。但TLR4是否参与脑出血后继发性损伤,是否通过介导炎性机制在脑水肿形成的病理生理演变过程中发挥作用,至今尚不清楚。 水通道蛋白4(Aquaporin 4, AQP4)是焦点，作

3、为一种与水通透有关的细胞膜转运蛋白，影响水跨膜转运和调节细胞内外环境平衡。在正常脑组织中主要分布于邻近毛细血管壁的星形胶质细胞足突上和脑室周围的室管膜细胞，成为水在细胞、血管和脑室移动的关键部位20。 星形胶质细胞瘤中AQP4表达明显上调,并与脑水肿程度、血脑屏障的开放有显著的相关性21。多种脑水肿实验模型均显示AQP4在脑水肿的发生发展中扮演重要角色22，23。实验表明：炎性反应可上调AQP4的表达。在过敏原和IL-13诱导的哮喘小鼠模型中24,炎性反应显著，基底膜侧的AQP4表达上调是特征性的改变。AQP4在实验性自身免疫脑脊髓炎模型的脑皮质和脊髓中表达也上调25,提示AQP4可能与急性期

4、炎症的发展相关。张新宇等26通过在大鼠脑内微量注射炎性因子TNF-后，发现早期就可出现脑水肿，并测得AQP4明显上调、血脑屏障通透性显著增加，且二者成显著正相关。因此，炎性因子诱发脑水肿的机制可能是：通过多种途径破坏血脑屏障，继而诱导AQP4表达上调，进一步加重脑水肿，形成恶性循环。进而推测：TLR4作为炎性信号通路转导受体，激活下游强有力的炎性级联反应，介导炎性损伤, 极有可能也通过诱导AQP4表达上调,参与脑水肿形成。但目前，国内外缺乏此方面的研究。 本课题采用大鼠尾状核立体定向注射自体血模型，研究TLR4 是否通过介导炎性反应，上调AQP4表达参与脑出血后脑水肿形成，探索TLR4 在脑出

5、血继发性损伤中脑水肿形成的炎性机制。具体内容：1、从基因分子水平，研究时间演变过程中TLR4mRNA 、TNF-mRNA 表达与AQP4mRNA 表达、脑出血后脑水肿程度的相关性。2、并与蛋白、细胞水平结合，研究脑出血损伤后TLR4、TNF- 与AQP4 在时空上的变化及联系。 1、实验动物及分组 实验一：65 只SD 大鼠将其随机分为手术组(A1 组，n=30)、假手术组(B1 组，n=30)、空白对照组(C1组，n=5)。A1 组和B1 组按手术后处死的时间再分为1h 组、6h 组、24h 组、72h组，5d 组，7d 组，每组各为5 只。在相应的时间点处死大鼠后测量大鼠脑的含水量、脑组织

6、TLR4mRNA、TNF-mRNA、AQP4mRNA 的表达测定。 实验二：65 只SD 大鼠65 只SD 大鼠将其随机分为手术组(A1 组，n=30)、假手术组(B1 组，n=30)、空白对照组(C1组，n=5)。A1 组和B1 组按手术后处死的时间再分为1h 组、6h 组、24h 组、72h组，5d 组，7d 组，每组各为5 只。在相应的时间点处死大鼠后测量于测定TLR4、TNF-与AQP4 的蛋白水平。 1 大鼠实验性脑出血模型的制备: 采用大鼠尾状核注射自体血模型: 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，立体定位仪定位下，在颅骨前囟前0.2mm，中线右侧旁3mm 处钻一直径为1.5mm 圆孔，

7、深达硬脑膜。用微量进样器沿孔垂直进针约6mm，手术组(A 组)将自体新鲜非抗凝动脉血50uL 20min 内缓慢推注入脑(相当于尾状核的位置)，假手术组(B 组)将生理盐水50uL 20min 内缓慢推注入脑，留置10min 后缓慢拔针。空白对照组(C 组)不进针手术。各组动物届时断头处死, 处死前进行神经功能评定。脑组织标本的采取: 实验一：在各时间点将大鼠麻醉后断头取脑，以脑血肿处为界，将脑组织分为前半部、后半部分。前半部用于脑含水量的测定；后半部用于TLR4mRNA、TNF-mRNA、AQP4mRNA 的测定。 实验二：术后在相应时间点乙醚麻醉动物, 从左心室插管至主动根部，生理盐水快速

8、灌注之后，多聚甲醛快速灌注固定，断头取脑,以注射针道为中心做冠状切片,厚度约5 mm. 标本按常规程序制成厚度5m的石蜡切片。相邻切片分别行HE染色病理观察、及TLR4、TNF-、AQP4免疫组化检测3 脑含水量的测定： 取每只大鼠右侧大脑半球穿刺点前半部的脑组织分别称重(湿重)，然后置入100恒温烤箱中，24h后取出再称重(干重)。以(湿重干重)湿重100计算脑含水量，以此代表脑水肿的程度。免疫组化法检测冠状脑切片TLR4、TNF-、AQP4蛋白水平及对脑组织行RT-PCR分析TLR4、TNF-、AQP4。 （一）承担单位概况(人员、资产、业务与管理状况) 在相关国内外研究的基本动态和技术的

9、基础上，我们具有一批能够参与该方面研究的人员。本课题组成员对相关学科的实验技术熟练，实验方法可靠，可重复性强，并已进行一些前期的研究，取得了初步经验。另外，申报单位具有国家重点实验室的平台，其实验设备与技术完全能满足该项目的需要。因此，探索脑出血继发性损伤机制，寻找炎性信号转导治疗靶点，我们认为从研究人员，到研究技术和研究条件都具有可行性。 （二）本项目现有的研究工作基础(包括现有科研装备条件) 我院呼吸疾病国家重点实验室已具备了动物造模、RT-PCR、免疫组化等实验技术的所需设备：动物头颅立体定位仪(SN- 2 ,NA RISHIGE，日本)、电子分析天平(BP211D ，塞多利斯，德国)、

10、PCR热循环仪（日本Techne公司）、全自动紫外分光光度仪（美国Perkin Elmer公司）、电泳凝胶图像分析仪（上海Tanon公司）、高速低温离心机（德国Universal 公司）、电泳仪( PowerP acB asic,BIO一RAD，美国)、石蜡切片机(德国Leica RM-2135)、光学显微镜(日本Olympus)、显微镜摄像系统(日本Olympus)等。该国家重点实验室及我院病理科可为实验提供有力的技术支持。脑出血后TLR4作为炎性信号通路转导受体，激活下游强有力的炎性级联反应，通过诱导AQP4表达上调,参与脑水肿形成。TNF-通过诱导AQP4表达上调，参与脑出血后脑水肿的形

11、成。 起止时间 主要工作内容 2013 年 10 月 - 2013 年 12 月 实验前期准备，定购试剂、耗材、大鼠，预实验。 2014年 1 月 - 2014 年 3月 完成实验一：手术造模、依各时间点脑组织取材，测定脑含水量、RT-PCR 方法测定TLR4mRNA、TNF-mRNA、AQP4mRNA 的表达。 2014年 4 月 - 2014年 6月完成实验二：手术造模、依各时间点脑组织取材，冠状脑切片行HE 染色病理观察，免疫组化法检测TLR4、TNF-、AQP4 蛋白。 2014年 6 月 - 2014年 7月 整理数据，统计分析。 2014年 7 月 - 2014年 10 月 撰写论文、投稿。1、专用业务费：1）标本、样品采集加工费：5000 元2）测试费：6500 元3）试验动物养殖费：25027=3500 元4）其他（管理费、协作费、劳务费、论文版面费）：5000 元2、原材料费：1）RT-PCR 试剂（Trizol、DEPC、DNase、逆转录试剂盒、微量加样枪、TLR4、TNF-、AQP4 及内参引物设