硅胶柱色谱层析 杨列超

1、目录柱层析原理柱层析原理柱层析装柱方法柱层析装柱方法柱层析上样方法柱层析上样方法注意事项注意事项 一、柱层析原理一、柱层析原理1、柱层析技术、柱层析技术(chromatography) 又称柱色谱技术，又称柱色谱技术，主要原理是根据样品主要原理是根据样品 混合物中各组分在固定相和混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。离开来。 2、柱层析操作时，先在圆柱管中先填充不溶性基柱层析操作时，先在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流

2、动相。在样品从柱子上殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。配将组分分离。 常用溶剂的极性常用溶剂的极性 常用溶剂的极性顺序：石油醚环己烷常用溶剂的极性顺序：石油醚环己烷/己烷苯己烷苯乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水甲醇水 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统极性大

3、的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸二、二、柱层析装柱方法柱层析装柱方法 1、操作要点、操作要点：装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。吸附剂外漏。 装柱子（添硅胶）时，有装柱子（添硅胶）时，有两种两种方法：即方法：即湿法装柱湿法装柱和干法装柱和干法装柱，二者各有优劣。，二者各有优劣。不论干法还是湿法，不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要硅胶（固定相）的上表面一定要平整，平整，并且硅胶并且硅胶（固定相）的高度一般为（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于

4、扩散或拖尾导致分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。分离效果不好。 （1）湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，）湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂 “走柱子走柱子”，本法最大的本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。泡。（2）干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后）干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，然后再填入硅胶至合适高度，最后再

5、用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子走柱子”，一般淋洗剂是采用一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。下面再用油泵抽，这样可以加快速度。 干法装柱较方便干法装柱较方便，但最大的缺陷在于，但最大的缺陷在于“走柱子走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），摸柱子明显感觉到），容易产生气泡容易产生气泡，这一点在，这一点在使用低沸点的淋洗

6、剂时如乙醚，二氯甲烷更为明使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。分离了。 解决的办法是：第一、硅胶一定要填结实；第二、解决的办法是：第一、硅胶一定要填结实；第二、一定要用较多的溶剂一定要用较多的溶剂“走柱子走柱子”，一定要到柱子，一定要到柱子的下端不再

7、发烫，恢复到室温后再撤去压力。的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。要。 匀浆法：匀浆法： 搅成匀浆。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙乙酸乙酯酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体

8、系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。柱。 三、柱层析的上样方法三、柱层析的上样方法 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，制成体积小、浓度高的样品溶液，加入层析柱中制成

9、体积小、浓度高的样品溶液，加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂，则硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂，则将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量硅胶将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量硅胶（不超过柱中硅胶全量的（不超过柱中硅胶全量的1/10）与其拌匀，除尽与其拌匀，除尽溶剂，将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶（始终保溶剂，将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶（始终保持洗脱剂有一定的液面），再覆盖一层硅胶即可。持洗脱剂有一定的液面），再覆盖一层硅胶即可。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀样品用少量溶剂溶

10、解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较加入。然后用少量溶剂洗涤后，

11、再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。用淋洗剂淋洗。 淋洗剂一般采用淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。靠扩散作用来分离，效果

12、也不会好。 上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持硅胶上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持硅胶上端表面平整；上样量为硅胶的上端表面平整；上样量为硅胶的1/601/30。 洗脱洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，一般一般TLC展展开时开时Rf 值为值为0.20.3的溶剂系统是最佳的洗脱系的溶剂系统是最佳的洗脱系统，采用梯度洗脱法洗脱。统，采用梯度洗脱法洗脱。 先打开柱下端活塞，先打开柱下端活塞，保持洗脱剂流速保持洗脱剂流速12滴滴/秒。上端不断添加洗脱剂秒。上端不断添加洗脱剂（可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相（可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近

13、）。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂近）。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。 洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。 收集处理收集处理 等份收集洗脱液，每份收集量大概与所用硅胶的等份收集洗脱液，每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查，合并含量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查，合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合物，不易析出单体成分的结