细胞培养技术

1、冯晓桃广西中医药科学实验中心l从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。1、条件可控：研究影响因素2、体外： 可用各种手段研究3、长期： 遗传性状4、大量提供条件相同的细胞1、科学研究药物研究与开发 l新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等。l疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。l基因

2、工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等。l细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 l单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生机理。 2、生物制药 l疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。l基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等。 l诊断用和药用单克隆抗体生产。 l细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等。（一） 实

3、验室准备l1. 无菌操作实验室 无菌操作间、缓冲间、更衣室等。 2. 生物安全柜（超净工作台） 生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。 生物安全柜分类 一级：可保护工作人员和环境而不保护样品，目前已很少用。 二级：提供工作人员、环境和产品的保护。l A（A1和A2）l B（B1和B2）l 三级：生物安全3、4级实验室用。ESCO AC2-4S1l3.相关仪器设备 （1）CO2培养箱 （2）倒置显微镜、普通显微镜及照相系统 （3）冰箱（4度，-20

4、度，-80度） （4）超纯水系统（电阻率 18.2M.cm ） （5）细胞存储器（液氮罐，深低温冰箱、-80度冰箱） （6）高温高压灭菌装置、清洗装置 （7）滤菌相关仪器（针式滤器，泵加压过滤） （8）离心机、天平、pH仪、移液枪等l（二）培养用品 （1）培养瓶（25 、75 cm3） 培养板（96、48、24、12、6孔） 培养皿（各种直径规格） l（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。 （三）细胞培养用试剂 （1）培养基 MEM，DMEM，RPMI1640 4保存，避免光照；用前放在37温热。 （三）细胞培养用试剂 （1

5、）培养基 水 无机盐 氨基酸 维生素 其他成分葡萄糖、酚红、HEPES、丙酮酸钠 （三）细胞培养用试剂 （1）培养基 培养基选择：按提供细胞来源的要求准备。 什么情况下选择无酚红培养基： 酚红影响到实验结果 流式细胞仪检测细胞样品（三）细胞培养用试剂（2）血清 l血清分类l1、特级胎牛血清（最高级别的） （1）Hyclone 北美特级胎牛血清北美特级胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特级胎牛血清北美特级胎牛血清（16000-044）l2、优等级胎牛血清（1）Hyclone加拿大优等胎牛血清加拿大优等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亚优等胎牛血清澳大利亚

6、优等胎牛血清（SH30084）（3）Gibco澳大利亚胎牛血清澳大利亚胎牛血清（10099-141）l血清分类l3、普通进口胎牛血清 l 如如Hyclone南美胎牛血清南美胎牛血清（SV30087）l4、国产的各种系列胎牛血清 国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤分装。l5、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般国产的。（三）细胞培养用试剂（2）血清 使用：5 20%。 保存：20-70储存； 4存放勿超过一个月。 解冻步骤： -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装或使用。 （三）细胞培养用试

7、剂l血清解冻后发现有絮状物出现，该如何处理? 原因：脂蛋白的变性； 血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，也是造成絮状物的主要原因之一。这些絮状物的产生不会影响血清本身的质量。 去除方法：可以将血清分装至无菌离心管内，以400g 稍微离心，将上清液加入培养基内一起过滤。我们不建议您直接过滤血清以去除这些絮状物，因为它可能会阻塞过滤膜。 （三）细胞培养用试剂 血清热灭活： 56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。目的：使血清中补体成份失活。 启动的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研

8、究、培养ES 细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 除非必须，一般不建议作此热处理。 （二）细胞培养用试剂 （3）缓冲液 Hanks、PBS 4保存，避免光照；用前放在37温热。 （4）抗生素 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-

9、) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds （5）添加因子 生长因子（ EGF、FGF、BFGF）、胰岛素、肝素、二巯基乙醇等 （6）消化液 胰酶（0.25%、0.125%）、EDTA（0.02%） 消化效果与浓度、温度、时间、pH值等相关 （三）细胞培养用试剂 （7）其他 谷氨酰胺： 终浓度2 mmol/L HEPES： 10-25 mmol/L 丙

10、酮酸钠： 终浓度1 mmol/L 2-巯基乙醇：终浓度50 uM1.细胞培养介绍.flv （一）基本操作 1. 无菌操作 防止微生物污染； 培养用一切物品、液体都无菌。 （37度预热，或室温平衡） 2. 操作区消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和着装 4. 实验操作 动作稳、准，幅度小； 物品摆放合理，工作有序，缩短暴露时间。 2.灭菌消毒.flv （二）细胞来源 1. 原代培养 从机体上取下细胞、组织或器官，让它们在体外维持与生长。（实际中，传10代以内的细胞用作原代培养细胞） 特点：表现来源组织或细胞特征。 （二）细胞来源 （1） 组织

11、块培养法 从机体上取下组织，使其在体外维持与生长，细胞从组织块边缘向外长出，铺满培养瓶（皿），即可进行传代。 特点：表现来源组织或细胞特征。 （二）细胞来源 （1） 组织块培养法 基本过程： 无菌条件下，取组织，去掉组织表面血污 剪成小块（0.5 1 mm3） 反复漂洗 （Hanks液和完全培养液） 接种于培养皿，培养箱培养 长满后传代 （二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。 优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长较快。 缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细胞有损伤。 （二）细胞来

12、源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 l原代培养期l传代期l衰退期（二）细胞来源 3.细胞株（cell strain） 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细

13、胞群，亦可称之为亚株（substrain）。 细胞库： 美国菌种保藏中心（ATCC） / 中国典型培养物保藏中心中国典型培养物保藏中心 上海细胞库上海细胞库 各科研机构各科研机构 培养细胞的生长方式l贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型。l悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。l游离期l贴壁期l潜伏期l对数生长期l停止期（平台期）l游离期：l 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。l 10分钟一

14、4小时l贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。l 底物底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等l 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。l进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）l潜伏期l 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。l对数生长期：l 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。l停止期（平台期）：l 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。l 机制：接触抑制、密度依赖性（三）细胞培养常规操作技

15、术 1. 细胞传代培养 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 贴壁细胞传代操作流程： （1）弃去培养液。 （2）加入胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 （3）消化时间约为1 3分钟。倒置镜下观察细胞。原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间出现空隙，细胞未漂起时弃去胰酶，同时用Hanks或培养液终止消化。 （4）制作细胞悬液，细胞计数（有经验者可省），根据细胞数目和细胞生长特点，按1:2

16、1:6进行传代，置37下继续培养。 附：消化液配制方法： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca 2+ 、Mg 2+ 的Hanks液（D-Hanks ）溶解，滤器过滤除菌，4保存，用前可在37下回温。 可配成1%溶液， -20保存，用前稀释成0.25%。 胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02。3.细胞传代.flv 2. 细胞冻存 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水

17、份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。细胞冻存操作 （1）收集对数生长期细胞，细胞定量。 （2）加入保护液（10%DMSO），调整至410106/ml左右。 （3）将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 （4）将冻存管口封严。 （5）贴上标签，写明细胞名称、代数、冻存日期等。 （6）标准降温速度： -1-2 /min； 温度达到-25 时，-5-10 /min； 到-70 时，直接放入液氮。 细胞冻存操作 一般降温顺序：室温4（20分钟低温冰箱（20 30 min）超低温冰箱（

18、80 ）或直接放入液氮。 注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用11.5月。 细胞冻存量很大时：可用细胞冻存仪。置80 冰箱过夜后，直接放入液氮保存。 冻存液配制： 培养基加入甘油或DMSO，使其终浓度达520%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4下保存。4.细胞冻存.flv 3. 细胞复苏 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。 3. 细胞复苏 操作： （1）从液氮中取出冻存管、迅速置于37 温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 （2）打开冻存管，将细胞悬液吸到离

19、心管中，加10ml培养液或Hanks液，1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 （3）细胞沉淀加10ml培养液或Hanks液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。 （4）加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况。 解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。 细胞复苏 高清.kux4. 细胞计数及活力测定 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程

20、对细胞是否有损伤作用。 （1） 细胞计数 A. 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 B. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 C. 静置3分钟。 D. 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：l 细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104 （1） 细胞计数 注意： 细胞要分散成单个细胞； 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液； 对于压线的细胞：只计算上线和左线。 （1） 细胞计数 另外：可以用细胞计数仪。 （2） 细胞活力测定 A. MTT法

21、 B. XTT法 C. CCK-8法 l5. 细胞增殖检测 （1）MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。l缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的

22、有机溶剂对实验者也有损害。 （2）XTT法 XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲瓒产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲瓒产物的吸光度与活细胞的数量成正比。l优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。l缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。 （3）CCK-8法或称

23、WST-8法lCCK-8试剂中含有WST8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。l （3）CCK-8法或称WST-8法l优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需

24、要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。l缺点：1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。 操作步骤： a. 96孔板细胞经过干预处理 b. MTT法：去掉培养液，加入80ul培养液+20ulMTT（0.5%） XTT法：直接加入XTT 50ul （0.1%XTT+1.5%硫酸甲醋吩嗦PMS：1ml：30ul） CCK-8：直接加入CCK-8 10ul c. MTT法：培养4 h，加

25、入DMSO 150ul溶解结晶，酶标仪检测。 XTT法：培养4 h，酶标仪检测。 CCK-8：培养1-4 h，酶标仪检测。 MTT法XTT法CCK-8法甲瓒物水溶性难溶性水溶性水溶性检测波长490 nm450nm450nm性状粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用毋需预制使用有机溶剂DMSO或其它溶剂 方便性+检测速度+重复性+稳定性+工作量-对细胞毒性-对人体毒性-（4）BrdU法（5）实时监测系统 l6. 细胞周期分析 6. 细胞周期分析 细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 G1期（first g

26、ap）从有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。 6. 细胞周期分析 G1期（first gap）细胞进入G1期后，并不是毫无例外地都进入下一期继续增殖，在此时可能会出现三种不同前景的细胞：增殖细胞：这种细胞能及时从G1期进入S期，并保持旺盛的分裂能力。暂不增殖细胞或休止细胞（G0期）：这类细胞进入G1期后不立即转入S期，在需要时，如损伤、手术等，才进入S期继续增殖。不增殖细胞：此种细胞进入G1期后，失去分裂能力，终身处于G

27、1期，最后通过分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神经细胞、肌细胞及成熟的红细胞等。 6. 细胞周期分析 S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。 G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。 分析方法： （1）显微镜下细胞形态分析； （2）BrdU法； （3）流式细胞术：明确各期细胞数及百分比。 7. 细胞凋亡分析 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因基控制的细胞自主的有序的死亡。 形态学形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单

28、个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 7. 细胞凋亡分析 （1） 电镜检查：在电镜下可见细胞膜表面凸出形成典型的凋亡小体，内含有正常形态的线粒体和其他细胞器。细胞质高度浓缩。核染色质浓缩成月牙状，同

29、时形成一些核仁碎片，核膜凹陷使胞核裂开。 （2）DNA检测：凋亡细胞的基因组DNA核小体之间连接的双链DNA被切断，从而产生180-200bp的多倍体DNA片段。应用琼脂糖凝胶电泳出现一典型的DNA梯形(DNA ladder)，与坏死细胞出现的DNA随机降解带型有明显的区别。7. 细胞凋亡分析 （3）TdT介导的dUTP缺口标记分析法：细胞在凋亡时，其基因组DNA在核小体之间被切断，产生许多3-OH末端。用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将地高辛标记的dUTP掺入到DNA片段的3-OH末端，然后再加入经荧光标记的抗地高辛抗体，使其与地高辛特异结合，在荧光显微镜下，凋亡细胞呈现黄绿色荧光。 （4）应用流式细胞仪分析 8. 细胞培养过程中常见的问题 （1）培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染 。 （2）培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染。 （3）细胞不