第十章微生物分类,鉴定和菌种保藏

1、第十章第十章 微生物的分类、鉴定微生物的分类、鉴定和菌种保藏和菌种保藏Taxonomy, Identification, Conservation of Microbiology微生物分类鉴定目的微生物分类鉴定目的 分类是人类认识微生物，进而利用和改造微分类是人类认识微生物，进而利用和改造微生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关系，为人类开发利用微生物资源提供依据。系，为人类开发利用微生物资源提

2、供依据。 Phylogeny of the Living World-Overview第一节第一节 微微 生生 物物 分分 类类 学学微生物分类学微生物分类学(Taxonomy) 是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（成条理清楚的各种分类单元或分类群（Taxon）的科学的科学 分类学的任务分类学的任务 分类（分类（Classification）：是指根据相似性或）：是指根据相似性或亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中 命名（命名（Nomenclature）：是按照国际命名法）：是按照国际

3、命名法规给予有机体一个科学的名称规给予有机体一个科学的名称 鉴定（鉴定（Identification）：是指确定一个新分）：是指确定一个新分离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。 一、微生物的分类单位一、微生物的分类单位界（界（Kingdom） 门（门（Phylum or Division） 纲（纲（Class） 目（目（Order） 科（科（Family） 属（属（Genus） 种（种（Species） 种是最基本的分类单位。种是最基本的分类单位。 但分类单元之间科加入亚门、亚纲、亚目、亚但分类单元之间科加入亚门、亚纲、亚目、亚科等次要分类单位。

4、种以下又可分为亚种、变科等次要分类单位。种以下又可分为亚种、变种、型、菌株等种、型、菌株等 微生物种与亚种的概念微生物种与亚种的概念种种(Species) 凡是于典型培养菌紧密相同的其他培养菌共同统凡是于典型培养菌紧密相同的其他培养菌共同统一起来，区分为细菌的一个种（一起来，区分为细菌的一个种（Species），即是），即是以某个以某个“典型菌株典型菌株”为代表、十分类似的菌株的总称。为代表、十分类似的菌株的总称。1987年，国际细菌分类委员会颁布，年，国际细菌分类委员会颁布，DNA同源同源 70%，而且其，而且其Tm5oC的菌群为一个种的菌群为一个种 亚种（亚种（Subspecies) 在种

5、内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表型上仅存在较小的某些差异，在种内分成型上仅存在较小的某些差异，在种内分成2个或个或2个个以上的分类单位，即为亚种以上的分类单位，即为亚种微生物亚种以下的变型分类微生物亚种以下的变型分类亚种以下亚种以下 生物变型生物变型表示特殊的生化或生理特征表示特殊的生化或生理特征 血清变型血清变型表示抗原结构不同表示抗原结构不同 致病变型致病变型表示某些寄主的专一致病性表示某些寄主的专一致病性 噬菌变型噬菌变型表示对噬菌体的特异性反应表示对噬菌体的特异性反应 形态变型形态变型表示特殊的形态特征表示特殊的形态特征 微微 生生

6、物物 的的 菌菌 株株菌株菌株(Strain)或称品系或称品系 是指同种微生物不同来源的纯培养物即单个分是指同种微生物不同来源的纯培养物即单个分离物的纯培养后代，常以数字、字母、人命或地名离物的纯培养后代，常以数字、字母、人命或地名等表示等表示 分离物是指已分离得到但为经鉴定的纯培养物分离物是指已分离得到但为经鉴定的纯培养物的后代即为分离物的后代即为分离物 群群(Group) 为工作方便而将近似的种或介于种间的菌株按为工作方便而将近似的种或介于种间的菌株按其形态或结合生理生化、生态特征归为若干类群。其形态或结合生理生化、生态特征归为若干类群。如放线菌中的链霉菌属内的种归为如放线菌中的链霉菌属内

7、的种归为12个类群个类群 二、微二、微 生生 物物 的的 命命 名名1 微生物的命名按国际命名法命名，即微生物的命名按国际命名法命名，即Linna所创立的所创立的“双名法双名法” 每一种微生物都用属与种命名，由每一种微生物都用属与种命名，由2个拉丁词或希腊个拉丁词或希腊词或拉丁化了的其他文字组成。属名和种名用斜体表词或拉丁化了的其他文字组成。属名和种名用斜体表达达 属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形态、属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形态、某科学家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母某科学家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母大写大写 种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，

8、描种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，描述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学家的名字等等家的名字等等 在种名后，附上命名者的姓和命名年份在种名后，附上命名者的姓和命名年份 微微 生生 物物 的的 命命 名名2 2 如命名对象是新种，需在种名后加如命名对象是新种，需在种名后加n.sp (即即novo species) 如仅泛指某一属的微生物，或某属微生物内的某些如仅泛指某一属的微生物，或某属微生物内的某些种，则在属名后用种，则在属名后用sp.（单数时）或（单数时）或spp.（复数时）（复数时） 如需表示变种，则在变种学名前加如需表示变

9、种，则在变种学名前加var., 变种学名命变种学名命名原则与种名的命名同名原则与种名的命名同 Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 属名：葡萄球菌属名：葡萄球菌 种名：金黄色种名：金黄色 命名者姓命名者姓 命名年命名年份份 Bacillus subtilis var. niger Desulfotomaculum thermoacetoxidans n. sp. Strain CAMZ三、微生物系统发育分析三、微生物系统发育分析 由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形成一由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴定技

10、术与套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，即系统发育地位。即系统发育地位。 原核生物细胞中的原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列都是十分保守的，不受微生物所的碱基序列都是十分保守的，不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变化，都可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物化，都可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。因此，分析原核生物细胞中的进化的真实痕迹。

11、因此，分析原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列，比的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间较所分析的微生物与其他微生物种之间16S rDNA和和18S rDNA序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。系的距离和系统发育地位。 系统发育研究方法系统发育研究方法 除了选择除了选择16S rDNA和和18S rDNA作序列分析作序列分析进行系统发育比较外，进行系统发育比较外， 还可利用间隔序列还可利用间隔序列(ITS)、某些发育较为古老而序列又较稳定的特、某些发育较为古老而

12、序列又较稳定的特异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。 如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶（GST）的基因序列分析所获得的系统发育鉴）的基因序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻合的一致性。合的一致性。系统学系统学（systematics） 系统学（系统学（systematics）是研究生物多样性及其分类）是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。分子系统学是检测、描述并揭示生和演化关系的科学。分子系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平

13、上的多样性及其演化规律的科学。研究内物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。等领域。 群体遗传结构群体遗传结构(population genetic structure)是指一是指一个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是一个种最基础的遗传信息。一个种最基础的遗传信息。 分类学分类学(taxonomy)是研究物种的界定和序级确定。是研究物种的界定和序级确定。系统发育关系系统发育关系(phylogenetic relationsh

14、ip)和分子进化和分子进化(molecular evolution)是两个密切相关的过程。是两个密切相关的过程。 在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大量的分类单元尤其是种的遗传信息后，来推断和重建微量的分类单元尤其是种的遗传信息后，来推断和重建微生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。 细菌系统发育树细菌系统发育树古菌的系统发育树古菌的系统发育树第二节第二节 原核微生物分类系统原核微生物分类系统一、原核微生物伯杰氏分类系统一、原核微生物伯杰氏分类系统伯杰氏细菌鉴定手册伯杰氏细菌鉴

15、定手册 伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册细细 菌菌 分分 类类 系系 统统最有代表性和最有影响的细菌分类系统最有代表性和最有影响的细菌分类系统 伯杰氏细菌鉴定手册伯杰氏细菌鉴定手册 （Bergeys Manual of Determinative Bacteriology) 1923年年, 1925年年, 1930年年, 1934年年, 1939年年, 1948年年, 1957年年, 1974年分别出版了第一至第年分别出版了第一至第八版，八版，1994年出了第九版年出了第九版 以形态、生理生化、以形态、生理生化、G + C mol%、生态分布、生态分布等特征为主等特征为主伯杰氏系统细菌

16、学手册伯杰氏系统细菌学手册（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001 以生理生化、以生理生化、G + C mol%、系统发育地、系统发育地位等为主位等为主体现了现代分子生物学的体现了现代分子生物学的研究成果研究成果 尚未出齐尚未出齐细菌的分类高级单位细菌的分类高级单位原核生物界原核生物界（Procaryotae) 薄壁菌门薄壁菌门(Gracilicutes) 暗细菌纲暗细菌纲 (Scotobacteria) 无氧光细菌纲无氧光细菌纲(Anoxyphotobacteria) 产氧光细菌纲产氧光细菌纲(Oxypho

17、tobacteria) 厚壁菌门厚壁菌门(Fimicutes) 厚壁菌纲厚壁菌纲(Fimibacteria) 放线菌纲放线菌纲 (Thallobacteria) 软壁菌纲软壁菌纲(Tenericutes) 柔膜菌纲柔膜菌纲 (Mollicutes) 疵壁菌门疵壁菌门(Mendosicutes) 古细菌纲古细菌纲(Archarbacteria)二、关于变形细菌二、关于变形细菌(Proteobacteria)纲纲 1 运用运用DNA/RNA杂交、杂交、16S rRNA编目法和编目法和16S rRNA序列序列分析方法对革兰氏阴性细菌系统发育研究的结果相当一致。分析方法对革兰氏阴性细菌系统发育研究的结

18、果相当一致。在研究过程中，发现在研究过程中，发现“紫细菌和相关细菌紫细菌和相关细菌”，尽管在表型和基，尽管在表型和基因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上具因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上具有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。1988年，年，Stackebrandt等将这类革兰氏阴性细菌命名为等将这类革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌变形细菌”（Proteobacteria），其下由），其下由a-亚纲、亚纲、b-亚纲，亚纲，g-亚纲、亚纲、d-亚纲和亚纲和e-亚纲。亚纲。关于变形细菌关于变形细菌(Proteobacteria

19、)纲纲 2 a-亚纲亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能无机营包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能无机营养型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌养型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌（Agrobacterium）、根瘤菌）、根瘤菌(Rhizobium)、红假单胞菌、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、发酵单胞菌、发酵单胞菌(Zymomonas)、副球菌等、副球菌等(Paracoccus)、立克次氏体（、立克次氏体（Rickettsia）等。）等。 b-亚纲亚纲由由Woese于于1984年提出，包括的菌群有色杆菌属年提

20、出，包括的菌群有色杆菌属(Chromobacterium)，水螺菌属，水螺菌属(Aquaspirillum)，紫色杆菌，紫色杆菌(Janthinobacterium)，德克斯氏菌，德克斯氏菌(Derxia)，丛毛单胞菌，丛毛单胞菌(Comamonas)，嗜木杆菌（嗜木杆菌（Xylophilus）等。）等。 g-亚纲亚纲由由Weose1985年提出，包括了肠杆菌科年提出，包括了肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，气单胞菌科气单胞菌科(Aeromonadaceae)，弧菌科，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德菌科，巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，假单胞菌，假单胞

21、菌(Pseudomonas)，海洋螺菌，海洋螺菌(Oceanospirillum)，黄单胞菌，黄单胞菌(Xanthomonas)，溶杆菌，溶杆菌(Lysobacter)等等 d-亚纲亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌(Bdellovibrio)和黏细菌目和黏细菌目(Myxococcales)的的6个代表。个代表。 e-亚纲亚纲仅有弯曲杆菌仅有弯曲杆菌(Campylobacter)和螺杆菌和螺杆菌(Heliobacter)2属属。 变形变形菌纲菌纲细菌细菌 第三节第三节 原核微生物的分类原核微生物的分类鉴定方法鉴定方法 Cla

22、ssification and Identification of Procaryotes微生物的分类技术水平微生物的分类技术水平微生物分类中使用的技术水平微生物分类中使用的技术水平 细胞形态水平细胞形态水平 细胞组分水平细胞组分水平 蛋白质水平蛋白质水平 基因组水平基因组水平 微生物的分类方法微生物的分类方法 1经典分类鉴定法经典分类鉴定法 形态特征形态特征：个体个体 群体群体 生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生 长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）；长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）；酶（产酶种类，反应特性等）酶（产酶种类，反应特

23、性等） 生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求，生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求，宿主种类等宿主种类等 血清学反应血清学反应 噬菌体的敏感性噬菌体的敏感性 其他其他微生物的分类方法微生物的分类方法2 2数值分类法又称阿得逊氏法数值分类法又称阿得逊氏法（Adansonian classification) 以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性及生态特征为依据的反应和忍受性及生态特征为依据 由计算机计算两者之间的总近似值，列出相由计算机计算两者之间的总近似值，列出相似值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然后似值矩阵，将相似度高的菌株列在

24、一起，然后将矩阵图转换成树状谱（将矩阵图转换成树状谱（Dendrogram)(见下见下一张）一张）微生物的数值法分类微生物的数值法分类微生物的分类方法微生物的分类方法3化学分类法化学分类法（Chemotaxonomy） 根据微生物细胞的特征性化学组成分对微生物进根据微生物细胞的特征性化学组成分对微生物进行的分类方法行的分类方法 细菌细胞化学组分在分类上的应用细菌细胞化学组分在分类上的应用微生物分类方法微生物分类方法4 4遗传学分类方法遗传学分类方法 DNA中中G+C含量百分比分析含量百分比分析 细菌含量变化范围在细菌含量变化范围在25%75%，放线菌在，放线菌在37% 51%。2 种之间差异超

25、过种之间差异超过10%，肯定不是同一个种，肯定不是同一个种 DNA-DNA杂交杂交 测定杂合的百分数，如同一种，应为测定杂合的百分数，如同一种，应为100% DNA-rRNA杂交杂交 16SrRNA寡核苷酸的序列分析寡核苷酸的序列分析 分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关系远的分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关系远的在图上占据不同的位置在图上占据不同的位置 菌株菌株16S rRNA16S rRNA基因的分离基因的分离 从平板中直接挑取一环分离菌株细胞从平板中直接挑取一环分离菌株细胞, , 加入加入100L100L无无菌重蒸菌重蒸H H2 2O O中中, , 旋涡混匀后旋涡混匀后,

26、 , 沸水浴沸水浴2min, 12 000r 2min, 12 000r minmin-1-1离心离心5min, 5min, 上清液中即含上清液中即含16S rRNA16S rRNA基因，可直接基因，可直接用于用于PCRPCR扩增。扩增。 分离菌株分离菌株16S rRNA16S rRNA 基因的基因的PCRPCR扩增和序列测定的一扩增和序列测定的一般步骤为：般步骤为：16S rRNA16S rRNA基因的基因的PCRPCR引物：引物：5-AGAGT 5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3TTGAT CCTGG CTCAG-3；5-AAGGA GGTGA TCCAG 5-AAGG

27、A GGTGA TCCAG CCGCA-3CCGCA-3。扩增反应体积。扩增反应体积5050 L L，反应条件为，反应条件为9595预变预变性性5min5min，9494变性变性1min1min，5555退火退火1min1min，7272延伸延伸2min2min，共进行，共进行2929个循环，个循环，PCRPCR反应在反应在PTC-200PTC-200型热循环型热循环仪上进行。取仪上进行。取5 5 L L反应液在反应液在10g L10g L-1-1的琼脂糖凝胶上进行的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。电泳检测。 PCRPCR产物测序可由专门技术公司完成。产物测序可由专门技术公司完成。系统发育树的构建系

28、统发育树的构建 测序得到分离菌株测序得到分离菌株16S rDNA部分序列，此序列一般部分序列，此序列一般以以*.f.seq形式保存，可以用写字板或形式保存，可以用写字板或Editsequence软软件打开，将所得序列通过件打开，将所得序列通过Blast程序与程序与GenBank中核中核酸数据进行比对分析酸数据进行比对分析( /blast )。 具体步骤如下：点击网站中具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST下下Nucleotide-nucleotide BLAST blastn选项，将测选项，将测序所得序列粘贴在序所得序列粘贴

29、在“search”网页空白处，或输入测网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“blast”，然后点击，然后点击“format”，计算机自动开始搜索，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断从而初步判断16S rDNA鉴定结果。鉴定结果。 遗传距离矩阵遗传距离矩阵 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStarDNA

30、Star软件包中的软件包中的MegAlignMegAlign程序计算样本间程序计算样本间的遗传距离。由的遗传距离。由GenBankGenBank中得到相关菌株的序列，中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8Clustalx1.8程序进行程序进行DNADNA同源序列排列，并经同源序列排列，并经人工仔细核查。人工仔细核查。 在此基础上，序列输入在此基础上，序列输入Phylip3.6Phylip3.6软件包，以软件包，以简约法构建系统发育树。使用简约法构建系统发育树。使用Kimura 2-Kimura 2-parameterpa

31、rameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（法（BootstrapBootstrap）500500次重复检测，次重复检测，DNADNA序列变序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。异中的转换和颠换赋于相同的加权值。Phylogeny of the Living World-BacteriaPhyloge-ny of the Living World-BacteriaPhylogeny of the Living World-Archaea第四节第四节 微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏一、微生物菌种的保藏要求一、微生物菌种的保藏要求微生物菌种保藏的要求：微生物菌种保藏的要求： 是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，是广泛收集各种研究、教学和生产性菌种，满足各方面需求；满足各方面需求； 高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、高质量保