第20章 常用分子生物学技术的原理及应用(改)

1、生化教研室生化教研室 雷雷 康康 福福常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的 原理及应用原理及应用The Popular Technology in Molecular The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and ApplicationBiology: Principle and Application第第 二二 十十 章章分子杂交特性（见第二章）分子杂交特性（见第二章）印迹技术印迹技术探针技术探针技术核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 利用利用DNA变性与复性这一基本

2、性质来进行变性与复性这一基本性质来进行DNA或或RNA定性或定量分析的一种技术。定性或定量分析的一种技术。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理一种可以将目的微量的一种可以将目的微量的DNA片断扩增片断扩增100万倍以上的技术万倍以上的技术 PCR是一种模拟自然是一种模拟自然DNA复制过程的复制过程的核酸体外核酸体外扩增技术。扩增技术。 根据根据DNA变性、复性的特点设计。变性、复性的特点设计。1993年诺贝尔年诺贝尔化学奖获得者化学奖获得者Kary Mullis 1985年由年由 穆里斯穆里斯 首创。首创。 可将微量的目的可将微量的目的DNA片断的片断的数量扩增数量扩增10

3、0万倍以上。万倍以上。PCR扩增目的基因扩增目的基因各种PCR仪l含含Mg2+的缓冲液的缓冲液ldNTPl耐热耐热DNA聚合酶聚合酶lTag DNA聚合酶聚合酶l特异性引物特异性引物l一对分别与待扩增一对分别与待扩增DNA序列序列5端相端相同，同，3端互补的寡核苷酸片段。端互补的寡核苷酸片段。l模板模板DNA模板模板DNA引物引物Taq DNA聚合酶聚合酶dNTP含含Mg2+缓冲液缓冲液变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C使模板使模板DNA完全变性成单链。完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除的局部双链得以消除使引物和模板使引物和模板D

4、NA退火结合退火结合此温度下此温度下DNA聚合酶以聚合酶以dNTP 为底物催化为底物催化DNA链的延长链的延长三个步骤为一个循环，三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环轮模板进入下一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物引物A引物引物B变性（变性（95）6075859590807065555045403530退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/3/3/5/5/5/引物引物A引物引物B6075859590807065555045403530变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/5/DNA-PolDNA-PolD

5、NA-PolDNA-Pol5/5/5/5/5/5/5/60758595908070655550454035305/变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因组基因组DNADNA样品样品第一次循环第一次循环第二次循环第二次循环第三次循环第三次循环第四次循环第四次循环待扩增序列待扩增序列引物引物A引物引物B3/5/3/5/5/3/5/3/PCR的的用途用途基因突变基因突变分析分析基因的基因的体外突变体外突变目的基因目的基因的克隆的克隆DNA序列测定序列测定DNA和和RNA

6、的微量分析的微量分析1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。第三节第三节基因文库基因文库Gene Library 基因组基因组DNA文库文库

7、(genomic DNA library) cDNA文库文库(cDNA library) n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件