核酸提取及常见问题分析OKppt课件

1、核酸提取及常见问题分析核酸提取及常见问题分析第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研讨的主要对象，因此核分子，是分子生物学研讨的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最根本的操作根

2、本的操作 。第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介q 基因组基因组DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非基因组非基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNADNA的提取的提取 差速离心结合

3、差速离心结合SDS裂解法裂解法qCTABCTAB法原理植物法原理植物DNADNA提取经典提取经典方法方法CTABhexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸构成复合溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸构成复合物。物。该复合物在高盐溶液中该复合物在高盐溶液中0.7mol/L NaCl是可溶的，经过有机溶剂是可溶的，经过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参与乙醇沉淀即可使核酸分别抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参与乙醇沉淀即可使核酸分别出来。出来。注：注：CTAB溶液在

4、低于溶液在低于15 时会构成沉淀析出，因此在将其参与冰冷的时会构成沉淀析出，因此在将其参与冰冷的 植物资料之前必需预热，且离心时温度不要低于植物资料之前必需预热，且离心时温度不要低于15。qCTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl pH8.0EDTA pH8.0 NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%V/V运用前参与运用前参与Tris-HCl pH8.0提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNa

5、se活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分别；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分别；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，防止褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，防止褐变，使酚容易去除qCTABCTAB提取缓冲液的改良配方提取缓冲液的改良配方 组份组份 Tris-HCl pH8.0EDTA pH8.0NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%V/V运用前参与

6、运用前参与vPVP聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物，能与多酚构成一种不溶聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物，能与多酚构成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。qCTABCTAB法流程图法流程图植物资料植物资料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS SDS法原理法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温是一种阴离子去垢剂，在高温5565条件下能裂解细条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋

7、白变性，释放出核酸；胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度冰浴，使蛋白质及多糖浓度并降低温度冰浴，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份组份Tris-HCl pH8.0EDTA pH 8.0 NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS SDS法法DNADNA提取缓冲液提取缓冲液q SDS SDS法流程图法流程图 以动物组以动物组织为例织为例 动物组织动物组织

8、细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法生物方式：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：吸附资料结合法：吸附资料结合法：q根据核酸分别纯化方式的不同有：根据核酸分别纯化方式的不同有：硅质资料硅质资料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高

9、效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。物，从而到达分别目的。浓盐法：浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分别在盐溶液中溶解度不同，将二者分别有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物q碱

10、裂解法原理碱裂解法原理 染色体染色体DNA比质粒比质粒DNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子； 当用碱处置当用碱处置DNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNA在回到中性在回到中性pH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象； 变性染色体变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉淀，而复性的超螺旋质粒沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解形状存分子那么以溶解形状存在液相中，从而可经过离心将

11、两者分开。在液相中，从而可经过离心将两者分开。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀枯燥溶解枯燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液q煮沸法原理煮沸法原理 染色体染色体DNA比质粒比质粒DNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子； 当加热处置当加热处置DNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天

12、然构象；在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成片段与变性蛋白质和细胞碎片结合构成沉淀，而复性的超螺旋质粒沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子那么以溶解形状存分子那么以溶解形状存在液相中，从而可经过离心将两者分开。在液相中，从而可经过离心将两者分开。q差速离心法原理差速离心法原理 是利用物质比重的不同分别混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分别混合物的一种方法。 将待分别物质置于均匀介质蔗糖中，以一定的转速进将待分别物质置于均匀介质蔗糖中，以一定的转速进展离心，比艰苦的物质优先沉降，比重小的却处于上层，展离心，比艰苦的物质优先沉降，比重小的却处于

13、上层，从而得以分别。从而得以分别。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，本身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，本身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因此在同一离心场内的沉降速度白，它们的比重和大小一定，因此在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分别出来。种组分分级分别出来。第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第

14、四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及其对策I.I.资料预备资料预备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分别、纯化核酸分别、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中最好运用新颖资料，低温保最好运用新颖资料，低温保管的样品资料不要反复冻融管的样品资料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞白细胞选择有

15、核细胞白细胞组培细胞培育时间不能过长，组培细胞培育时间不能过长，否那么会呵斥否那么会呵斥DNA降解降解含病毒的液体资料含病毒的液体资料DNA含量含量较少，提取前先富集较少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取运用途于对数期的新颖菌体运用途于对数期的新颖菌体老化菌体导致开环质粒添加老化菌体导致开环质粒添加培育时应参与挑选压力，否那培育时应参与挑选压力，否那么菌体易污染，质粒易丧失么菌体易污染，质粒易丧失尽量选择高拷贝的质粒，如为尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，那么应加大低拷贝或大质粒，那么应加大菌体用量菌体用量菌株不要频繁转接质粒丧失菌株不要

16、频繁转接质粒丧失资料应适量，过多会影响裂解，资料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同资料，选择适当的裂针对不同资料，选择适当的裂解预处置方式：解预处置方式：植物资料液氮研磨植物资料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培育基去除干净，同时保证菌培育基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不

17、要过长变性的时间不要过长5分钟，分钟，否那么质粒易被打断否那么质粒易被打断复性时间也不宜过长，否那么复性时间也不宜过长，否那么会有基因组会有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处置，以破壁用酶法或机械法处置，以破壁采用吸附资料吸附的方式分别采用吸附资料吸附的方式分别DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机酚采用有机酚/氯仿抽提时应充分混匀，但动作氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分别两相时，应保证一定的转速和时间离心分别两相时，应保证一定的转速和时间针对不同资料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同资料的特点，

18、在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取q 蛋白质的去除：蛋白质的去除：q 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提q 运用变性剂变性运用变性剂变性SDSSDS、异硫、异硫氰酸胍等氰酸胍等q 高盐洗涤高盐洗涤q 蛋白酶处置蛋白酶处置q 多糖的去除：多糖的去除：q 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与中参与1/21/2体积的体积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解，高盐可溶解多糖。多糖。q 用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。q 在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的

19、氯苯(1/2(1/2体体积积) )，氯苯可以与多糖的羟基作用，从，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖而去除多糖 。q 用用PEG8000PEG8000替代乙醇沉淀替代乙醇沉淀DNADNA：在：在500L 500L DNADNA液中参与液中参与200l 20% PEG8000 (200l 20% PEG8000 (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除：q 在抽提液中参与防止酚类氧化的试剂：在抽提液中参与防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等硫苏糖醇等q 参与易

20、与酚类结合的试剂：如参与易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它们与酚类有较强的亲和力，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与，可防止酚类与DNADNA的结合的结合q 盐离子的去除：盐离子的去除：q 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时参与沉淀时参与1/10体积的体积的NaAcpH5.2，3M，有利于，有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后运用沉淀后运用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发不要过分枯燥，让乙醇

21、充分挥发不要过分枯燥假设长期储存建议运用假设长期储存建议运用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反响后续酶解反响DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质详细方法见前质详细

22、方法见前重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发添加添加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数次数2-32-3次次q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反反响。响。 缘由缘由对对策策资料不新颖或反复冻资料不新颖或反复冻融融未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性提取过程操作过于猛提取过程操作过于猛烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融尽量取新颖资料，低温保管资料防尽量取新颖资料，低温保管资料防止反复冻融止反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻

23、前参与裂解缓冲液前参与裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的资料在提取内源核酸酶含量丰富的资料的的DNADNA时，可添加裂解液中螯合剂时，可添加裂解液中螯合剂的含量的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔一切试剂用无菌水配制，耗材经高一切试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌将将DNADNA分装保管于缓冲液中，防止分装保管于缓冲液中，防止反复冻融反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 缘由缘由实验资料不佳或量少实验资料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丧失丧失尽量选用新颖幼嫩的资尽量选用新颖幼嫩的资

24、料料动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延伸高温裂解时，时间适当延伸对于动物细胞、细菌可添对于动物细胞、细菌可添加加PKPK的用量的用量低温沉淀，延伸沉淀时间低温沉淀，延伸沉淀时间加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 缘由缘由第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及

25、其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；分别位于整个体系

26、中的中间相和水相，从而得以分别； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真RNARNA。 q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步骤步骤: : 资料预备：尽量新颖。资料预备：尽量新颖。 裂解变性：异硫氰酸胍亚硫氢胍，巯基乙醇，裂解变性：异硫氰酸胍亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌月桂肌氨酸等。氨酸等。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效，有效抑制核酸酶。抑制核酸酶。 纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除氯仿可抽提去除杂物。杂物。 洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。 沉淀：异丙醇、无

27、水乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠乙酸钠pH4.0pH4.0：维持变性的细胞裂解液的：维持变性的细胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。q 资料：资料：q 新颖，切忌运用反复冻融的资料新颖，切忌运用反复冻融的资料q 如假设资料来源困难，且实验需求一定的如假设资料来源困难，且实验需求一定的时间间隔。可以先将资料储存在时间间隔。可以先将资料储存在TRIzolTRIzol或或样品储存液中，于样品储存液中，于7070或或2020保管保管q 如要多次提取，请分成多份保管如要多次提取，请分成多份保管q 液氮长期保管，液氮长期保

28、管，7070短期保管短期保管q 样品破碎及裂解：样品破碎及裂解：q 根据不同资料选择不同的处置方法：根据不同资料选择不同的处置方法：q 培育细胞：通常可直接加裂解液裂解培育细胞：通常可直接加裂解液裂解q 酵母和细菌：普通酵母和细菌：普通TRIzolTRIzol可直接裂解，对可直接裂解，对于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法破壁破壁q 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品坚持冷冻解液裂解。期间动作快速，样品坚持冷冻q 样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解q 为减少为减少DNADNA污染

29、，可适当加大裂解液的污染，可适当加大裂解液的用量用量q 纯化：纯化：q 在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；，且动作快速；q 经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，虽然沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易呵斥经济，但操作时间长，易呵斥 RNA RNA 降解降解；q 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响去除影响 RNA RNA 后续酶反响的杂质，是目后续酶反响的杂质，是目前较为理想的选择。前较为理想的选择。第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：D

30、NA提取常见问题、提取常见问题、缘由分析及其对策缘由分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、缘由分析及其对策问题、缘由分析及其对策q RNA RNA 的降解的降解 q OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳q 新颖细胞或组织：新颖细胞或组织：q 裂解液的质量裂解液的质量q 外源外源RNaseRNa

31、se的污染的污染q 裂解液的用量缺乏裂解液的用量缺乏q 组织裂解不充分组织裂解不充分q 另外某些富含内源酶的样品另外某些富含内源酶的样品 ( (如脾脏，胸腺如脾脏，胸腺等等) )，很难防止，很难防止 RNA RNA 的降解。的降解。q 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时运用更多裂解液。时运用更多裂解液。q 冷冻样品：冷冻样品：q 样品取材后应立刻置于液氮中速冻，样品取材后应立刻置于液氮中速冻，然后可以移至然后可以移至-70-70冰箱保管。样品要冰箱保管。样品要相对小一点；相对小一点；q 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；q 样品

32、与裂解液充分接触前防止融化，样品与裂解液充分接触前防止融化，研磨器具必需预冷，碾磨过程中及时研磨器具必需预冷，碾磨过程中及时补充液氮。补充液氮。OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值比值偏低偏低q 蛋白质污染：q 不要吸入中间层及有机相，参与氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。q 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底q 处理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：q 不要吸入中间层及有机相，参与氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。q 处理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值比值偏低偏低q

33、抽提试剂残留：抽提试剂残留：q 确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 RNARNA，并且彻底去掉，并且彻底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。q 处理方法处理方法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：设备限制：q 测定测定OD260 OD260 及及OD280 OD280 数值时，要使数值时，要使OD260 OD260 读数在读数在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之间。此范围线之间。此范围线性最好。性最好。q 用水稀释样品：用水稀释样品：q 测测 OD OD 时，对照及样品稀释液请运用时，对照及样品稀释液请运用 10 mM 10 mM TrisTris

34、，pH 7.5pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值。用水作为稀释液将导致比值的降低。的降低。 q 非变性电泳：非变性电泳：q 上样量超越上样量超越 3ug3ug，电压超越，电压超越 6V/cm6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均能够导致电泳缓冲液陈旧，均能够导致 28S 28S 和和 18S 18S 条带分不开。条带分不开。q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡：q EB EB 与单链的结合才干要差一些，故同与单链的结合才干要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；淡一些；q 甲醛的质量不高甲醛的质量不高 。q RNA 降解 q 抽提试剂的残留 q 75% 乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留q 多糖等杂质，再次沉淀 q DNA 污染 q 运用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA RTRT常见问题分析和处理方案常见问题分析和处理方案问题一：少量或没有问题一：少量或没有RT-PCRRT-PCR产物产物RNARNA降解降解分别无污染，高质量的分别无污染，高质量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂7070v/vv/v乙醇清洗乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNARNA量太低量太低添加添加RNARNA的量的