微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析

1、微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方 法。试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高； EDTA 定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较 为准确和方便。因此，乳酸脱氢酶法适合于高精度、高效率的检测；EDTA定钙法适合于迅速简便、精度要求不高的检测；羟基联苯比色法可作为企业或科研单位 精度要求不高的常规检测。关键词：发酵饲料；乳酸；羟基联苯比色法；EDTA定钙法；乳酸脱氢酶法Comparative An

2、alysis of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy, convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic ac

3、?id dehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method, but the costwas higher. The test of EDTA titration meth?od was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results

4、of hydroxybiphenol colorimetry method was preferably, the methods had good specificity and convenient. Consequently, lactic acid dehydrogenase method wasfit for the tests require high precision and high efficiency. The EDTAtitration method was fit for the tests requiresimple and rapid, but the accur

5、acy didn t ask for much. The hydroxybiphenol colorimetry method was used for rou ?tine undemanding accuracy test result in enterprise or institutes of scientific research.Key words: microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymetho d;EDTAtitrationmeth ?od;lacticaciddehydrogenasem

6、ethod收稿日期：2012-03-22 基金项目：龙岩市科技计划重点项目(2011LY18) 作者简介：罗建(1962)，男，福建龙岩人，硕士，研究方向为饲料的研发、生产与应用。* 通讯作者：教授，硕士生导师，E-mailLyyxy198837 饲料博览 2012 年第 5 期 检测分析 微生物发酵饲料的生产与应用是近年来饲料工 业和养殖业最热门的话题之一。随着人民生活水平 的不断提高和环境资源的日益恶化，利用农副产品 和轻工副产物生产高质量、无污染的微生物发酵饲 料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜禽产品品质、 减少畜产品药物抗生素残留的重要手段。微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和

7、芽孢 菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪 肠球菌3种 2 。乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条 件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制 其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微 生物发酵饲料 3 。因此，发酵饲料中乳酸含量的高 低是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指 标。目前，乳酸含量的测定方法主要有羟基联苯比 色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法（HPLC）、酶法等，均有各自的适用范围和优缺点 4-7 。本文 通过比较分析微生物发酵饲料中不同乳酸测定方 法，以期得到适合于中小型饲料厂或科研单位快 速、简便检测产品乳酸含量的方法。1 材料与方法1.1 试验材料微生物发酵饲料

8、由福建省龙岩市金和动物饲料 有限公司提供。在规定的发酵时间内发酵完成后取 样品1g，测定其乳酸含量。1.2 乳酸测定方法1.2.1羟基联苯比色法标准曲线的绘制：分别配置乳酸标准液14、5、6 口 g mL-1，在比色管中分别加入乳酸标准液1 mL、4.0%硫酸铜溶液0.05 mL，再加入浓硫酸6 mL，反应5 min，冷却至20 C以下后， 再分别于各比色管中加入 1%碱溶性羟基联苯溶液0.05 mL ，混合均匀，在室温下放置 68 h，过夜，在570 nm下进行比色测定，绘制出标准曲线 8 。样品测定：1 g发酵饲料溶解于100 mL 蒸馏水 中，4 000 rpm离心10 min，取上清液

9、1 mL，按标准曲线测定样品中乳酸含量（ %）。1.2.2 EDTA 定钙法 称取样品 1 g（准确至0.0002 g）于100 mL 杯 中，加水 80 mL，在电炉上加热至近沸，继续加热5 min（溶液不要溢出），冷却，定容至100 mL，待溶液澄清后（或过滤） ，吸取上清液（滤液）10 mL 于锥形瓶中，加三乙醇胺10 mL 、蒸馏水50 mL200 g L-1氢氧化钠溶液10 mL 、盐酸羟胺0.5 g 摇匀 后，再加钙混合指示剂少许，立即用 EDTA标准溶 液0.05 moL L-1 滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终 点。乳酸的测定结果计算公式见式（1 ）。乳酸浓度（g L-1 ）=90

10、.08 x CXV（1） 式中，V 为滴定所消耗EDTA 溶液体积（mL）；C 为EDTA 浓度（moL-L-1 ）；90.08 为乳酸的摩尔质量。 为便于与其他方法测定结果比较，乳酸的测定 结果最终转换成每克饲料乳酸含量（% ）。1.2.3乳酸脱氢酶法 酶法测定乳酸含量操作步骤见表1。 酶法乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程有 限公司，按照其使用说明，预先配置好酶工作液和 反应显色剂（标准液和终止液试剂盒中已配好，直 接使用）。取饲料样品1g 溶解于50 mL蒸馏水中，4 000 rpm离心10 min，取上清液待测，蒸馏水调 零，测定波长为530 nm。测定结果计算公式见式（2 ）。 式中

11、，C为样品浓度mmoL L-150为样品稀释倍数。同理，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳 酸含量（%）。2 结果与分析2.13种方法测定发酵饲料乳酸含量 分别采用羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法测3种方法对同一发酵批次的微生物发 酵饲料进行测定，取样3 批、每批重复3次，进行 统计学分析，结果见表2。 试剂 蒸馏水3 mmoL-L-1 标准液 样本 酶工作液 显色剂 混匀，37 C水浴准确反应10 min 终止液 加样管 空白管 0.020.22 标准管0.0210.22测定管0.0210.22表 1 酶法测定乳酸含量操作步骤 mL乳酸浓度(mmoL L-1)(2)382012年

12、第 5 期 饲料博览检测分析由表2可知，同一批次间和不同批次间检测， 平均误差最小的方法是乳酸脱氢酶法，最差的是 EDTA定钙法；对于同一批次检测结果，羟基联苯 比色法和乳酸脱氢酶法检测结果差异不显著( P >0.05)，而与EDTA定钙法差异显著( P<0.05)。2.23种方法测定发酵饲料乳酸含量应用性分析3种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析结果见表3。由表3可知，3种方法中，乳酸脱氢酶法检测 的准确性最好，操作也最为简便，且检测时间也最 短，但成本较为昂贵；EDTA定钙法虽然操作简 便，检测时间也不太长，但检测准确性最差，误差 较大，结果较不可靠；羟基联苯比色法检测效果处 于

13、另外两个方法之间，检测较为准确和方便。3 讨论 发酵饲料中乳酸含量的高低是判断其产品品质 优劣的一个非常重要指标，但目前我国对饲料中乳 酸含量的测定方法报道较少。本文探讨了3种检测 发酵饲料中乳酸含量的方法，结果表明，乳酸脱氢 酶法检测的准确性最好、迅速，但成本较高，该方 法适用于某特定时期抽检样品，需迅速得到准确结 果的场合；EDTA定钙法检测的准确性最差，但操 作简便、迅速，只适用于只需得到检测样品乳酸含 量大概数值的场合；羟基联苯比色法检测效果居 中，可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检 测发酵饲料样品中乳酸含量的一种方法。发酵液中乳酸含量的测定方法还有HPLC法、 生物传感器法等。

14、这两种方法检测结果可靠、快捷 迅速、专业性强，并可同时检测产品中其他物质 （如有机酸、葡萄糖等）的含量。樊永红试验结果表 明，在同一发酵批次的乳酸含量测试中，EDTA 定钙法与HPLC法、生物传感仪法有显著差异( P<0.05)，而HPLC法与生物传感仪法无显著性差异(P>0.05)；EDTA定钙法简便快速，但重复性差；HPLC法准确、灵敏；生物传感仪测定法比较准确和 方便 9 。如发酵饲料生产企业有财力购置相关的设 备，此方法也可作为微生物发酵饲料中乳酸含量的 检测方法，检测结果可能更为真实可靠。 参 考 文 献 1 陆文清发酵饲料生产与应用技术M.北京中国轻工业出版 社, 20

15、11. 2 林标声J罗建J戴爱玲微生物发酵饲料对断奶仔猪生长性能的影响J.安徽农业科学, 2010, 38（5）: 2 378-2 380. 3 余伯良发酵饲料生产与应用新技术M.北京中国农业出版社, 1999. 4 高庆J印建和J穆华容对羟基联苯法测定啤酒中乳酸J.酿酒, 2005（6）: 93-95. 5 郑志J姜绍通J潘丽军. EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的 探讨J.食品科学, 2003, 24（3）: 102-105. 6 白冬梅J班睿J赵学明反相高效液相色谱法测定米根霉乳 酸发酵液中的乳酸J. 色谱 , 2000, 18 （6） : 527-528. 7 柳畅先 度浔吴士钧 酶

16、法测定乳酸J. 分析试验室 , 2005, 24 （9）: 75-77. 8 梁琼J鲁明波J卢正东对羟基联苯法定量测定发酵液中的 乳酸J. 食品科学 , 2008, 29 （ 6 ） : 357-360.樊永红王丽J柳丹米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法 研究J.生物技术, 2007, 17(1): 54-55.注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著( P <0.05)，肩标不同大写字母者表示差异极显著( P<0.01)，肩标相同写字母或不标注者 表示差异不显著( P>0.05)。提取方法羟基联苯比色法EDTA 定钙法乳酸脱氢酶法 准确性 较好 最好 成本 居中 便宜日虫昂贵 操作繁简 较繁琐 简便 简便 检测时间 较长 适中 很短 测定方法 羟基联苯比色法 EDTA 定钙法