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文档简介
1、 分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学。它是生态学与分子生物学相互渗透的形成的一门新兴交叉学科,其研究内容包括种群在分子水平的遗传多样性及遗传结构,生物器官变异的分子机制,生物体内有机大分子对环境因子变化的响应,生物大分子结构、功能演变与环境长期变化的关系以及其他生命层次生态现象的分子机理等。 微生物群落结构和多样性是微生物生态学微生物群落结构和多样性是微生物生态学 研究的热点内容研究的热点内容p群落结构决定了生态功能的特性和强弱。p群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。p群落结构变化是标记环境变化的重要方面。通过对环境微生物
2、群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化,可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。 20世纪70年代以前:传统的培养分离方法,依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数,认识是不全面和有选择性的,方法的分辨水平低。微生物群落结构和多样性研究方法:微生物群落结构和多样性研究方法: 在70和80年代:对微生物化学成分的分析,建立了一些微生物分类和定量的方法(生物标记物方法),对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代:现代分子生物学技术以DNA为目标物,通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法,比较精确地揭示了微生物种类和遗传
3、的多样性,并给出了关于群落结构的直观信息。可以检测环境中的活细胞,并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。采用配比简单的营养基质和固定的培养温度,还忽略了气候变化和生物相互作用的影响,这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 (不到1 % )。Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%(海水)到0.3%(土壤)。 不能全面地反映微生物区系组成状况,烦琐、耗时。1、传统的微生物培养法、传统的微生物培养法培养条件培养条件 营养限制营养限制 失去生态位失去生态位 微生物不可培养的原因微生物不可培养的原因2、群落水平生理学指纹方法、群落水平生
4、理学指纹方法(CLPP)微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质,则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP),通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。具体而言,CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力,来确定哪些基质可以作为能源,从而产生对基质利用的生理代谢指纹。 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分,其总量通常与相应生物量呈正相关。 特定的标记物标志着特定的微生物,一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对
5、比例)可作为指纹估价微生物群落结构。 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来,然后对提取物进行纯化,后用合适的仪器加以定量测定。优点:不需要把微生物的细胞从环境样中分离,能克服由于培养而导致的微生物种群变化,具有一定的客观性。醌指纹法醌指纹法(Quinones Profiling) 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分,约占细胞干重的5%。在细胞死亡时,细胞膜很快被降解,磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉,因此它只在活细胞中存在,十分适合于微生物群落的动态监测。磷脂脂肪酸(磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)、甲基脂肪)、甲基脂肪酸酯(酸酯(Fatty a
6、cid methyl ester, FAME)谱图分析)谱图分析 脂肪酸具有属的特异性,特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。 甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物,气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。 磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来,然后用气相色谱分析,得出PLFA谱图。 PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化变化,能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸肪酸,但是也有其局限性。但是也有其局限性。 第一第一,他不能从种的水品上鉴定微生物他不能从种的水品上鉴定微生物,只能只能鉴定到属鉴定到
7、属; 第二第二,这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸,标标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计,因此操作因此操作过程需要十分谨慎过程需要十分谨慎,防止人为因素的干扰。防止人为因素的干扰。 第三第三,细菌和真菌在不同的生长时期以及环境细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化压力下的脂肪酸含量有所变化,给监测带来困难。给监测带来困难。 另外,不同微生物种属之间脂肪酸组成有重另外,不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠,外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群叠,外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。结构解析的可
8、靠性。 在微生物群落中,各细菌数量占1-10%时,其特征性ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERIC-PCR指纹图中,每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段,条带的数目反映微生物类群的多少,条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。 分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指纹图谱的差异,就可比较不同生态系统微生物群落的差异,或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。5. 以以PCR为基础的为基础的rRNA及及rDNA的分析方法的分析方法 用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包括:核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机
9、基因组序列等。 最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定,同时含有保守序列及高可变序列,是微生物系统分类的一个重要指标。 变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的,起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)。 此后十年间,该技术被广
10、泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 。 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开,但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样,不能被区分。 DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度,从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。 一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成,其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。 一个几百
11、个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域,每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域,横坐标是该DNA 片段的序列,依次从第一个碱基到第234 个碱基;纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 MD1 是解链温度最低的一个解链区域,MD3 是温度最高的一个解链区域。 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样,所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 当它们进行DGGE时,一开始变性剂浓度比较小,不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链,此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶
12、中一样。 一旦DNA 片段迁移到一定位置,其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链,部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此,不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降,从而在胶中被区分开来。 然而,当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时,DNA 片段会完全解链,此时它们又能在胶中继续迁移,这些片段就不能被区分开来。 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段(GC 夹子,一般30-50 个碱基对)可以解决这个问题。 含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高,可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。 当加了GC 夹子后
13、,DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。 当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时,要结合PCR(polymerase chain reaction)扩增技术,用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。 通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物,其中一个引物的5-端含有一段GC 夹子,用来扩增微生物群落基因组总DNA,扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断,所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。40%60%DenaturantCABCBADen
14、aturing Gradient Gel ElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16S rDNA 环境样品的核酸提取在土壤微生物生态中非常重要。环境样品的核酸提取在土壤微生物生态中非常重要。最初采用的方法主要是剧烈的最初采用的方法主要是剧烈的机械打碎以及超声波破碎机械打碎以及超声波破碎细胞细胞。但是这种方法得到的。但是这种方法得到的DNA片断一般在片断一般在5K10K大大小小,不适合作微生物的群落分析。微生物细胞与环境中不适合作微生物的群落分析。微生物细胞与环境中的土壤颗粒、粘土以及有机物接合紧密的土壤颗粒、粘土以及有机物接合紧密,这对高效率提这对高效率提取
15、核酸造成了很大的困难。同时取核酸造成了很大的困难。同时,腐植酸腐植酸对对DNA的检测的检测和定量也有很大的影响和定量也有很大的影响,主要表现在抑制主要表现在抑制DNA高温聚合高温聚合酶的活性酶的活性,干扰限制酶的位点识别干扰限制酶的位点识别,降低转化效率以及降低转化效率以及DNA杂交的特异性。杂交的特异性。Jizhong Zhou等人研究了各种提等人研究了各种提取方法取方法,他们将土壤样品他们将土壤样品DNA提取分为细胞裂解粗提提取分为细胞裂解粗提DNA和纯化两个步骤和纯化两个步骤,并将几种方法进行比较并将几种方法进行比较,建立了一建立了一种对大多数土壤样品简单、快速、高效的基于种对大多数土壤
16、样品简单、快速、高效的基于SDS的提的提取方法。很多实验表明取方法。很多实验表明,现在能够从土壤样品中提取出现在能够从土壤样品中提取出超过超过90%的的rDNA 基于基于PCR技术的方法也存在着不足技术的方法也存在着不足: 环境样品在提取核酸前的厌氧或室温存放不可避环境样品在提取核酸前的厌氧或室温存放不可避免的导致其样品中微生物的变化免的导致其样品中微生物的变化,冷冻可以减缓变化冷冻可以减缓变化,但是不能存放时间过长但是不能存放时间过长,真菌在真菌在04摄氏度仍可以观摄氏度仍可以观察到明显的生长现象。察到明显的生长现象。 每次提取每次提取DNA的效率不同的效率不同,造成结果重复性差。造成结果重
17、复性差。 某些原核生物细胞比其他细胞容易裂解某些原核生物细胞比其他细胞容易裂解,引起裂解引起裂解程度不均一程度不均一,使得不易裂解的细胞的丰度估计过低。使得不易裂解的细胞的丰度估计过低。 引物对不同样品的扩增效率不同引物对不同样品的扩增效率不同,引起丰度估计偏引起丰度估计偏差。差。 理论上理论上,对真核生物的分析应该象原核生物一样进对真核生物的分析应该象原核生物一样进行行,但是由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节但是由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节机制比较复杂机制比较复杂,对其的研究还不够透彻对其的研究还不够透彻,现今应用在真现今应用在真核微生物生态学的分析上还是比较少。核微生物生态学
18、的分析上还是比较少。l 随机引物扩增多态性方法(RAPD)l 限制性片断长度多态性技术(RFLP)l 变性梯度凝胶电泳与温度梯度凝胶电泳技术l 扩增片段长度多态性(AFLP)l 单链构象多态性 PCR技术(SSCD) DNA 限制性内切酶具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能,DNA 分子由于突变(核苷酸的置换、插入或缺失)改变(或形成)了限制性内切酶识别序列,使DNA 限制性内切酶不能(或可以)将靶DNA 片段切断,电泳检测时,存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段变成短片段;不存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段长度将不发生变化。
19、随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 亦称随机引物PCR(Arbitrarily Primed PCR, AP-PCR),是Willam和Welsh于1990年建立的基因分型方法。该方法是建立在PCR基础上的新的检测基因组多态性的基因分型技术,它利用采用随机选择的单条或多条8-12mer引物经PCR扩增基因组DNA片段,然后通过凝胶电泳分析其DNA指纹图谱,其结果既表现种系发育过程的相互联系,也反映了不同克隆之间存在的差异,从而可鉴定不同菌株在基因水平上的差异。 双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于分子
20、大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度,从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。 AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物,其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段,再使双链人工接头的酶切片段相边接,作为扩增反应的模板 DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加 13个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分
21、离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或 少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析。在随后的研究中,科学家又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-
22、SSCP技术,进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性. 基本过程是基本过程是: PCR扩增靶DNA; 将特异的PCR扩增产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; 将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果. 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变. 末端限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是限制性片段长度多态性技术(RFLP)的扩展,它
23、集RFLP、PCR和核酸电泳技术于一体9210。该方法依据微生物的比较基因组学信息,选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列为目的分析序列,并据此设计出理想引物,用荧光物质标记出1个或2个引物的5端(2个引物同时标记时,要用不同的荧光物质标记)。常用的荧光物质有四氯荧光素TET (52tetrachloro fluorescein) 11、绿色的六氯荧光素HEX (52hexachloro 2fluorescein)9以及蓝色的六羧基荧光素62FAM 等。扩增后的PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化,荧光标记末端片段可被测序仪识别,得到不同的末端片段峰,每一个峰就可至少代表一种类型的微生物,
24、通常用系统分类操作单元(OTU)来表示。故根据片段峰的大小和数量可以检测和分析环境样品中微生物的末端限制性片段图谱,进而可分析出微生物群体的组成和动态变化等生态信息 高通量测序技术(High-throughput sequencin)高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑,该技术可以对数百万个 DNA 分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,因此也称其为深度测序 ( deep sequencing) 或 下一代测序技术( next generation sequencing, NGS)2005 年,454 Life Sciences 公司( 现已被
25、 Roche 公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统, 开创了第二代测序技术的先河。该技术的原理是酶级联化学发光反应: 首先将 PCR 扩增的单链 DNA 与引物杂交, 并与 DNA 聚合酶、 ATP 硫酸化酶、 荧光素酶、 三磷酸腺苷双磷酸酶、 底物荧光素酶和 5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种 dNTP,若该 dNTP 与模板配对, 聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦磷酸盐被硫酸化酶转化为 ATP, ATP 就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD 检测后通过软件转化为一个峰值, 峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比 。 高通量测序技术有三大优点是传统 Sanger测序法所不具备的第一,它利用芯片进行测序, 可以在数百万个点上同时阅读测序。第二,高通量测序技术有完美的定量功能, 这是因为样品中某种 DNA 被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。第三,成本低廉。Mardis E R Next-generation DNA sequencing methods Annu Rev Genomics Hum Genet, 2008, 9: 387-402Sultan M, Schulz M H, Richard H, et al A global view of ge
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