产蛋白酶毛霉的分离筛选及发酵豆粕产大豆肽的初步研究

1、现代食品科技Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9产蛋白酶毛霉的分离筛选及发酵豆粕产大豆肽的初步研究庞宗文，李敏，李树波，梁静娟（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）摘要：采用脱脂乳平板透明圈法和麸皮培养基发酵测定法筛选到一株产蛋白酶活力较强的毛霉菌株HN201。以蛋白酶活力、游离氨基含量、活性肽活性为指标，对筛选得到的HN201菌株固态发酵豆粕产蛋白酶及大豆肽的最优条件进行研究。研究表明，28 发酵培养96 h时总蛋白酶活力最高；游离氨基含量随着培养时间的增加而增加，培养120 h时达到77 mmol/L，是

2、发酵前的17倍；培养96 h时产生的大豆肽具有最高还原能力，是相同浓度Vc还原能力的85%左右，是发酵前的1.8倍；培养48 h时产生的大豆肽清除DPPH的能力最高，约是相同浓度Vc清除能力的60%，是发酵前的3.5倍；清除超氧阴离子自由基的能力随培养时间和温度的变化很小，发酵后无明显提高。SDS-PAGE电泳分析可知，豆粕发酵所产大豆肽分子量主要集中在10 kD以下。关键词：毛霉；豆粕发酵；大豆肽 文章篇号：1673-9078(2010)9-956-961Screening of a Protease-producing Mucor Strain for Soybean PeptidesPr

3、oduction with Fermented Soybean MealPANG Zong-wen, LI min, LI Shu-bo, LIANG Jing-juan(College of Life Science and Technology of Guangxi University, Nanning 530005, China)Abstract: A new strain of Mucor, HN201, was screened using the method of clear zone resulting from hydrolysis of casein in plate a

4、nd fermentation in wheat bran medium, which produced high activity of protease. The optimal conditions for solid-state fermentation of soybean meal byHN201 to were studied based on the protease activity, free amino content and antioxidant capability of the soybean peptide. The highest protease activ

5、ity was achieved when fermentation temperature and time were 28 and 96 h, respectively. Free amino acid content of the fermented mixture increased to 77 mmol/L by prolonging the fermentation time to 120 h, which was 17 times higher than that of the unfermented soybean. The highest reducing capabilit

6、y and 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH)-scavenging capability of soybean peptides were observed at 96 h and 48 h, respectively, which were 3.5 and 1.8 times respectively higher than those of the unfermented soybean meal. Comparative study showed that its reducing capability and DPPH-scaveng

7、ing capability were 85% and 60% of Vc with same concentration. And little changes in its scavenging ability on superoxide anion radical were found after fermentation. Electrophoresis analysis showed that the molecular weight of soybean peptide were lower than 10 kD.Key words: Mucor strains; soybean

8、fermentation; soybean peptides蛋白酶广泛存在于微生物中。微生物产生的蛋白酶一般均为胞外酶1，与动植物来源的蛋白酶相比，其下游技术处理相对简单，成本较低。也由于微生物易于培养，生长周期短，因此微生物来源的蛋白酶易于大规模工业化生产。在我国，毛霉长期应用于豆腐乳等发酵豆制品中，合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力强，而且毛霉的胞外蛋白酶系对于大豆蛋白具有很收稿日期：2010-05-05作者简介：庞宗文（1964-），男，副教授，研究方向：微生物酶学、生物化工高的水解效率2。与黑曲霉和米曲霉蛋白酶相比，毛霉蛋白酶水解蛋白的产物没有苦味，适口性好，因此在大豆蛋白肽的生产中有很大

9、的潜力。豆粕是大豆榨油后的副产物，其蛋白质含量高达40%以上，一般作为饲料来处理。对豆粕的微生物发酵处理，主要是提高豆粕蛋白的溶解度，有效地降解其中的抗营养因子和大分子蛋白质，使豆粕更容易消化吸收。而且发酵豆粕具有一定的芳香气味和鲜味，适口性好。大豆肽具有抗氧化、抗疲劳、降血压和降血脂等956现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9多种生理功能，是一种非常有前途的功能性食品原料和肽类药物原料3。目前大豆肽大多采用条件温和、安全性高的酶水解法进行生产。但酶法生产大豆肽存在着酶价格昂贵，产物得率不高的缺陷，而且由于大豆

10、蛋白经酶水解后其疏水性氨基酸残基会暴露出来，限制了其在得到的大豆肽往往带有较明显的苦味45，食品中的应用。而利用微生物发酵法生产大豆肽，不仅解决了苦味问题，而且大大降低了生产成本。用微生物生产工业用大豆蛋白酶和用豆粕进行固态发酵生产大豆肽鲜见报道，本研究将筛选得到的产蛋白酶活力较强的毛霉菌株应用于豆粕的固态发酵中，对豆粕发酵水提物中的酶活力、游离氨基含量、大豆肽活性的最优条件进行了初步研究，以期为毛霉蛋白酶在固态发酵生产大豆多肽生产中的应用提供理论依据。 1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集土样采自广西南宁、钦州、防城港、桂林及海南等地，共55份。选择植被厚、枯枝落叶多、有机质丰富且

11、阴暗潮湿的土壤采集。 1.1.2 培养基（1）PDA培养基（%）：土豆 20，葡萄糖 2，琼脂 1.2，pH 6.0。（2）查氏培养基（%）：蛋白胨 0.5，葡萄糖 1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，琼脂 2，pH 6.0。（3）脱脂乳平板培养基（%）：脱脂乳 1.5，琼脂 2，pH 6.0。 （4）麸皮培养基：麸皮 9 g，豆粕 1 g，硫酸铵 0.05 g，水10 mL，pH 6.0。 （5）豆粕培养基：豆粕 9 g，麸皮 1 g，水10 mL，pH 6.0。 1.2 方法1.2.1 产蛋白酶毛霉菌株的分离筛选（1）分离 取土样5 g，加无菌水50 mL，于搅拌器上搅拌打散1

12、0 min。取1 mL上清悬浮液于EP管中，即为101稀释度的样液，依次按十倍级差稀释，即得一系列稀释度的样液。取0.1 mL不同的稀释度样液，涂布PDA分离平板，同一稀释度可同时涂多个平板。然后倒置于28 培养箱中培养，每隔24 h观察一次。根据毛霉的菌落、孢子颜色及菌落形态分离毛霉，进一步于光学显微镜下观察确定。（2）初筛小心取分离得到的毛霉菌株的极少孢子，点种于脱脂乳平板中央。置于28 培养箱中培养2 d，观察菌落周围是否产生透明圈，并测量透明圈与菌落的直径，挑选透明圈与菌落的直径比大，即产蛋白酶能力较强的毛霉菌株进行复筛。（3）复筛将初筛得到的产蛋白酶能力较强的毛霉菌株进行平板活化，接

13、入麸皮培养基中，拍打均匀，于28 恒温培养箱中培养72 h，于48 h时翻曲一次。制备粗酶液，测定粗酶液的蛋白酶活力，选择蛋白酶活力较高的毛霉菌株进行下一步研究。1.2.2 毛霉蛋白酶粗酶液的制备将发酵好的麸曲捣碎，取适量，加入十倍体积的0.3 mol/L NaCl溶液，40 水浴提取1 h，过滤离心即得粗酶液。1.2.3 发酵豆粕水提物的制备将蛋白酶活力较高的毛霉菌株接入豆粕培养基中，拍打均匀，于适当恒温培养箱中培养一定时间后于豆粕发酵曲中加入10倍体积的蒸馏水，40 水浴浸提1 h，过滤离心即得发酵豆粕水提物。 1.2.4 蛋白酶活力的测定采用紫外光谱法6稍加改进，于试管中加入1 mL酶液

14、，于40 水浴预热2 min，再加40 预热的2%酪蛋白溶液1 mL，精确反应10 min后，立即加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸（TCA）以中止反应，10 min后沉淀完全，离心。取1 mL上清液，加入对应pH值的（同一样品分别测定其Na2HPO4柠檬酸缓冲液5 mL在pH 6.0、7.0、8.0下的蛋白酶活力）。混匀后于275 nm下测吸光值。同时以先加2 mL TCA灭酶10 min后再加1 mL 2%酪蛋白的沉淀离心为空白对照。蛋白酶活力单位定义：1 mL液体酶在一定温度和pH条件下，1 min水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1个酶活力单位，以U/mL表示。酶活力（U/mL）=（

15、A×K×V×n）/（t×m）式中A为样品的吸光值；K为吸光常数，标准曲线中OD值为1时相当的酪氨酸微克数；V为反应试剂的总体积（mL）；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间（min）；m为酶液体积（mL）。1.2.5 游离氨基含量测定取5 mL样品，加入采用甲醛滴定法7稍加改进，60 mL蒸馏水，用0.05 mol/L NaOH调节pH为8.20，加入10 mL已中和的甲醛溶液，混匀，用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 9.20。记录消耗NaOH的体积V。用蒸馏水代替样品，操作方法相同，测得空白957现代食品科技 Modern Food Sc

16、ience and Technology 2010, Vol.26, No.9体积V0。游离氨基的量(mmol/L)1000×N×(V-V0)/5.0式中V为样品消耗的NaOH溶液体积，V0为空白体积，N为滴定所用的NaOH标准溶液浓度。乳平板上进行活性显色。具有蛋白酶活性的蛋白质条带会作用于脱脂乳平板中的酪蛋白形成透明带。 2 结果与讨论2.1 毛霉蛋白酶产生菌株的分离筛选从55份土样中共分离得到68个毛霉菌株。毛霉菌落质地疏松，呈棉絮状或绒毛状，菌丝体细密，呈雪白色。菌落低部不产色素，呈花瓣状扩展。光学显微镜下观察发现，其菌丝无横隔，无假根，孢子囊呈球形，呈单轴分支，孢

17、子圆形。将68个毛霉菌株分别点于脱脂乳平板上，培养2 d后可以观察到有一部分菌株周围产生肉眼可见的水解圈。水解圈直径和菌落直径的比值(D/d)大于2.0的菌株共有11株，结果见表1。表1 产蛋白酶菌株的初筛Table 1 Primary screening of the protease-producing strains 水解圈直径和菌落直径的比值（D/d）2.0菌株数量比例/%水解度DH(%)=(样品中游离氨基的量/C-0.33)/7.8×100式中C为样品中蛋白浓度(g/L)；0.33为大豆蛋白中游离氨基浓度(mmol/g)；7.8为每克大豆蛋白的肽键当量数(mmol/g)。1

18、.2.6 大豆肽活性的测定（1）还原能力的测定在1 mL样品（空白采用文献8的方法稍加改进，用蒸馏水代替）中加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液和2.5 mL的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6），混匀后在50 保温20 min，然后加入2.5 mL 10%的TCA，混和后10000 r/min离心5 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混匀后在700 nm下测定吸光度值。以Vc作为对照。（2）清除DPPH·自由基能力的测定采用文献9方法稍加改进，将2 mL无水乙醇与2 mL 250 mmol/L的DPPH（2,2-di

19、phenyl-1- picrylhydrazyl）溶液加入同一试管中，摇匀，避光反应30 min，用无水乙醇作参比于517 nm下测定吸光度值A0；测定样品清除能力时，将2 mL样液与2 mL 250 mol/L的DPPH溶液混匀于同一试管中，静置30 min，以同浓度样液为参比测定517 nm处吸光度值A。 自由基清除率计算：清除率(%)(A0-A)/A0×100 （3）清除超氧阴离子自由基能力的测定采用邻苯三酚自氧化法，根据文献10的方法，在4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2，内含2 mmol/L EDTA）中，加入4.2 mL蒸馏水后于25

20、 保温20 min，然后加入25 预热的45 mmol/L邻苯三酚0.3 mL（空白管用10 mmol/L HCl代替）。迅速摇匀，立即在420 nm下测吸光度值，每30 s记录一次，测4次，计算A0值。样液加入4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液中，减少相应蒸馏水的加入量，其余同上。测定420 nm下吸光度值，每30 s记录一次，测4次，计算A值。自由基清除率计算：清除率(%)(A0-A)/A0×100式中A0为邻苯三酚的自氧化速率，A为加入样液后邻苯三酚的自氧化速率。11 16.21.52.0 28 41.229 42.6 1.5将11株D/d大于2.0的菌

21、株分别接种到麸皮培养基中，发酵培养后提取粗酶液，离心取上清测定蛋白酶活力，结果见表2。从表2可知，HN201号菌株发酵后产生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶活力均为最高，因此选择该菌作进一步研究。表2 产蛋白酶菌株的复筛Table 2 Secondary screening of the protease-producing strains 菌株号酸性蛋白酶活力(U/mL)中性蛋白酶活力(U/mL)碱性蛋白酶活力(U/mL)FC5 96.49 117.60 101.18 HN6 76.72 113.91 118.94 HN7 89.79 119.94 139.04 HN9 85.77 11

22、9.61 139.04 HN11 73.71 HN12 84.43 HN14 66.00 HN17 91.13 HN201HN202102.52 128.65 132.34 135.35 80.41121.28116.60 131.00113.91 144.73 177.23 92.80 144.06 125.30QZ1 71.36 125.30 135.021.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色方法将毛霉产生的蛋白酶酶液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为7.5%。电泳结束后将胶条一分为二，一半用考马斯亮蓝染色，另一半平贴于脱脂958菌株HN201发酵后产生的蛋白酶经聚丙烯酰胺凝胶电

23、泳（PAGE）和在脱脂乳平板上活性显色检测，结果见图1。由图1可知，经PAGE出现三条主要蛋白带，经活性显色1 h出现一条水解带，对应考马斯现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9亮蓝染色电泳迁移最慢的一条主带。从这些结果可知，HN201主要产生一种蛋白酶。图3 不同发酵时间对豆粕发酵水提物中游离氨基含量的影响图1 HN201菌株发酵粗酶液非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图及蛋白酶活性显色图Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of the fermented soybean m

24、eal by HN201 and its protease activity analysis withdefatted milk plateFig.3 Effect of fermentation time on the free amino acidcontents in fermented soybean meal2.2 毛霉发酵豆粕产大豆肽的初步研究2.2.1 不同发酵时间对发酵豆粕产大豆肽的影响 2.2.1.1 不同发酵时间对豆粕发酵的蛋白酶活力的影响测定了豆粕发酵中不同发酵时间对豆粕发酵蛋白酶活力的影响，结果见图2。由图2可知，碱性蛋白酶活力在发酵72 h后达到最大值，为81.41

25、 U/mL，酸性及中性蛋白酶活力在发酵的96 h达到最大值，分别为79.40 U/mL和86.77 U/mL。总体来看，发酵培养到96 h的蛋白酶活力最高。2.2.1.3 不同发酵时间对豆粕发酵所得大豆肽肽活性的影响。（1）对大豆肽还原力的影响以Vc的还原力为100%作为对照，测定了不同发酵时间发酵豆粕水提物中的大豆肽还原力，吸光度值越大说明样品的还原能力越强。由图4结果可知，不同发酵时间发酵豆粕产生的大豆肽均具还原力，且发酵第96 h产生的大豆肽还原性最高，是Vc的85%左右。图4 不同发酵时间对豆粕发酵所得大豆肽还原能力的影响 Fig.4 Effect of fermentation ti

26、me on the reducing activity of thesoybean peptide（2）对清除DPPH·能力的影响图2 不同发酵时间对豆粕发酵的蛋白酶活力的影响 Fig.2 Effect of fermentation time on the activity of proteaseproduced by soybean meal fermentation2.2.1.2 不同发酵时间对豆粕发酵水提物中游离氨基含量的影响测定了豆粕发酵中不同发酵时间的豆粕发酵水提物的游离氨基含量，结果见图3。由图3可知，发酵水提物中游离氨基含量随着培养时间的增加而增加。水解度与游离氨基含

27、量的变化趋势一致，也随培养时间的增加而增加，在发酵120 h时，游离氨基含量为77 mmol/L，水解度为47.4%。图5 不同发酵时间对豆粕发酵所得大豆肽清除DPPH·能力的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the DPPH-scavengingcapability of the soybean peptide以Vc清除DPPH·的能力为100%作为对照，测定了959现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9豆粕发酵中不同发酵时间发酵豆粕水提物中的大豆

28、肽清除DPPH·的能力，结果如图5。由图5可知，豆粕发酵48 h产生的大豆肽具有最高清除DPPH·的能力，约为Vc的60%。（3）对清除超氧阴离子自由基能力的影响测定了豆粕发酵中不同发酵时间发酵大豆水提物中的大豆肽清除超氧阴离子自由基的能力，分别以A0、A、A1、A2、A3、A4和A5表示邻苯三酚自氧化速率、加入未发酵豆粕浸提液、培养36 h、48 h、72 h、96 h、120 h发酵豆粕水提物后邻苯三酚自氧化速率，结果见表3。由表3可知，培养48 h和120 h时发酵豆粕产生的大豆肽具有弱的清除超氧阴离子的能力，且发酵120 h的能力大于发酵48 h。总体上看，大豆肽对

29、超氧阴离子清除能力不高。图7 不同发酵温度对豆粕发酵水提物中游离氨基含量的影响 Fig.7 Effect of fermentation temperature on the free amino acidcontents in fermented soybean meal2.2.2.3 不同发酵温度对豆粕发酵所得大豆肽肽活性的影响（1）对大豆肽还原力的影响表3 不同发酵时间对豆粕发酵所得大豆肽清除O2·能力的影响 以Vc的还原力为100%作为对照，测定了不同发酵Table 3 Effect of fermentation time on the O-2·-scavengi

30、ng 温度发酵豆粕水提物中的大豆肽还原力，吸光度值越activity of the soybean peptide 大说明样品的还原能力越强，结果如图8。由图8可知，A0 A A1 A2 A3 A4 A5 不同发酵温度发酵豆粕产生的大豆肽均具有还原力，0.0006 0.0006 0.0006 0.00050.0006 0.00060.0004且在28下产生的大豆肽具有最高的还原性，约是Vc的85%。2.2.2 不同发酵温度对豆粕发酵的影响2.2.2.1 不同发酵温度对豆粕发酵的蛋白酶活力的影响测定了豆粕发酵中不同发酵温度对豆粕发酵蛋白酶活力的影响，结果见图6。由图6可知，发酵96 h，碱性蛋白

31、酶的活力在30 下达到最大值；酸性及中性蛋白酶活力在28 下达到最大值。总体上看，在28 下豆粕发酵的蛋白酶活力可达最大值。图8 不同发酵温度对豆粕发酵所得大豆肽还原能力的影响 Fig.8 Effect of fermentation temperature on the reducing activityof the soybean peptide（2）对清除DPPH·能力的影响图6 不同发酵温度对豆粕发酵的蛋白酶活力的影响 Fig.6 Effect of fermentation temperature on the activity ofprotease in fermente

32、d soybean meal2.2.2.2 不同发酵温度对豆粕发酵水提物中游离氨基含量的影响测定了不同发酵温度对豆粕发酵水提物中游离氨基含量的影响，结果见图7。由图7可知，在28 下豆粕发酵水提物中的氨基含量达最高值75.6 mmol/L，此时水解度也达最高值42.4%。960图9 不同温度对豆粕发酵所得大豆肽清除DPPH·能力的影响Fig.9 Effect of fermentation temperature on the DPPH-scavenging capability of the soybean peptide以Vc清除DPPH·的能力为100%作为对照，测定

33、了现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9豆粕发酵中不同发酵温度发酵豆粕水提物中的大豆肽清除DPPH·的能力，结果如图9。由图9可知，豆粕在26 的发酵条件下产生的大豆肽具有最高清除DPPH·的能力，约为Vc的50%。从总体上看，温度对发酵豆粕水提物清除DPPH·自由基能力的影响不大。（3）对清除超氧阴离子自由基能力的影响测定了豆粕发酵中不同发酵温度发酵豆粕水提物中的大豆肽清除超氧阴离子自由基的能力。实验结果表明均不具有此活性。2.2.3 豆粕发酵提取物大豆肽采用SDS-PAGE电泳方法研究了豆粕发酵提取物的大豆肽，结果见图10。由图10电泳图可知，毛霉发酵豆粕的提取物的大豆肽分子量集中在10 kD以下，说明利用毛霉