兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究(一)

1、兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究(一)    作者：张福勇，吴小涛，王运涛，鲍军平，朱磊，邱匀峰【摘要】 目的：初步探讨骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与纤维环（AF）细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响，进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法：分别培养兔的BMMSCs与AF细胞，将两种细胞按11的比例混匀，利用离心管培养技术培养3周后取材，大体观察并行HE染色；使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖；通过实时荧光PCR对型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果：在体外培养3周后，细胞团体积达到最大，涂片染

2、色显示共培养组细胞致密，细胞增殖较对照组明显，实时荧光PCR检测结果显示型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论：在离心管内三维培养条件下，BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖，增加型胶原和蛋白多糖的含量。 【关键词】 骨髓间充质干细胞； 纤维环细胞； 生物医学工程； 细胞培养； 兔下腰痛是一种常见的骨科疾患，发病率高，75%80的人在其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因，临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果，但并非针对椎间盘退变本身，目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退变1 。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间

3、盘有外层的纤维环（AF）、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复AF的完整性有着重要的意义2 。本研究观察骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与AF细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和型胶原的表达，达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。1 材料与方法1.1 实验仪器与材料实验仪器包括721分光光度计(上海市仪器厂)，高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，倒置荧光相差显微镜(德国Zeiss公司)，5%CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)，数码照相机(日本Canon公司)；实验材料有木瓜蛋白酶(E.Merck公司)，100%胎牛血

4、清(杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶(美国 Sigma公司)，台盼蓝试剂(美国Sigma公司)，塑料离心管(Corning公司)，LG-DMEM培养基、型胶原酶、Hoechst33258和Calf Thymus DNA等试剂（Gibco公司）;新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR委托上海拓科生物技术有限公司检测。1.2 实验步骤1.2.1 取材 BMMSCs的分离 取1月龄新西兰大白兔30只,雌雄不拘,体重0.50.6 kg，1%戊巴比妥钠按2 ml·kg-1 的剂量施以全身麻醉，无菌操作下切取兔的股骨,两端剪断,用PBS液冲洗,收集细胞,离心后用15的胎牛

5、血清DMEM培养液制备成细胞悬液,然后于37 、5CO2、100饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液，以后每隔3 d换液1次，培养至第3代3。 AF细胞的分离 取1月龄新西兰大白兔54只，雌雄不拘，体重0.50.6 kg，同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱，剔除周围软组织，取出椎间盘，放入含有PBS的培养皿内，用眼科剪去除终板及髓核组织，将AF的最外层及最内层去除，留取中间部分（图1），用PBS液冲洗3遍后，用眼科剪将组织剪成1 mm3大小，移入含有20 ml型胶原酶的培养皿内消化68 h，120目过滤器过滤后PBS液洗涤3遍，用15的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,置3

6、7 、5CO2、100饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液，以后每隔3 d换液1次，培养3周后待用4。图1 终板及髓核被清除后的AFFig 1 AF after nucleus pulposus and endplate were removed 共培养模型的建立及分组 单层培养的细胞经胰酶消化后，按照每管含5×105 BMMSCs、AF细胞或11的比例混合细胞，将细胞悬液移入15 ml塑料离心管内，再加入DMEM培养液至5 ml，其中含10的胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 g·ml-1链霉素，pH 7.4，以20×g的离心

7、力低速离心5 min形成微球，置于37 、5CO2、100饱和湿度下培养，由此形成3个观察组，即BMMSCs组、AF细胞组和共培养组。5 d后第1次换液，以后每隔3 d进行半量换液，培养至第21天对各项指标进行检测4。1.2.2 观察指标 组织学检查 取离心管内培养的细胞团，大体观察并涂片、固定，然后行HE染色，观察细胞形态和组织结构。 DNA含量测定 培养3周后，组织块用20 U·ml-1的木瓜蛋白酶消化过夜，采用Hoechst33258荧光法测定各离心管内细胞的DNA含量。20 l标本中加1 g·ml-1 的 Hoechst33258溶液2

8、ml，以牛胸腺DNA作为标准品绘制标准曲线，比较测定结果。 型胶原及蛋白多糖的PCR检测 细胞培养3周后,以Trizol试剂裂解细胞。实时荧光PCR法检测mRNA表达：应用Cyber Green法，实时荧光PCR在MJ OPTICON 2定量PCR检测仪上进行，实验结果用OPTICON Monitor Analysis软件分析。所用引物序列均由上海生工生物工程公司合成。型胶原蛋白正义链GACCCCATGCAGTACATG,反义链 GACGGTCTTGCCCCACTT；蛋白聚糖正义链GAGGTCGTGAAAGGTGT,反义链GTGTGGATGGGGTACCTGAC。1.3 统计学处

9、理结果采用SAS 8.1统计学软件分析，数据以x-±s表示。多组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 光镜及大体观察AF细胞贴壁速度相当缓慢,5 d后开始有部分细胞贴壁，15 d后细胞贴壁数目不再增多，初始细胞呈圆形，后呈多角形、梭形或不规则形状,轮廓清楚,细胞核呈圆形，见图2。 细胞悬液经离心后，在离心管底部形成小的细胞团，直径约1 mm。3 d后细胞团的体积逐渐增大，BMMSCs组细胞团松散易碎，共培养组细胞团紧密不易吹散，AF细胞组居中。至第3周时，细胞团体积达到最大，共培养组细胞团可达到6 mm，BMMSCs组细胞团未见明显

10、增大，AF细胞组细胞团体积略小于共培养组。2.2 细胞形态学观察至第3周时，HE染色观察细胞形态，AF细胞呈圆形或不规则形状，排列欠规整；BMMSCs呈椭圆形，排列稀疏欠规整；共培养组细胞呈圆形或不规则形状，细胞排列紧密，见图3。2.3 DNA含量测定在细胞接种后第1周，细胞DNA含量变化不明显；第2周时DNA含量共培养组迅速增加，AF细胞组稍增加，BMMSCs组减少；第3周时趋于稳定。共培养组DNA含量随时间延长而逐步增加，至第21天时明显高于BMMSCs及AF细胞组，差异有统计学意义（均P0.05,表 1）。 表1 培养不同时间细胞DNA含量测定结果2.4 型胶原及蛋白多糖mRNA的表达体

11、外培养3周的细胞经实时荧光PCR检测显示，共培养组细胞的型胶原及蛋白多糖基因表达明显高于AF细胞组及BMMSCs组（均P0.01，表2），且AF细胞组的表达量明显高于BMMSCs组（均P0.05）。表2 型胶原及蛋白多糖的mRNA表达(3 讨 论椎间盘随着年龄的增加以及各种因素的影响而逐渐发生退行性变化。椎间盘退变的病理改变之一为AF的应力损伤,导致AF微断裂,使髓核突出。在椎间盘退变的早期，具有修复能力的AF细胞上调蛋白多糖和其它间质中的大分子，内部AF蛋白多糖含量的增加可在一定程度上弥补成人早期髓核蛋白多糖的下降5。退变晚期的椎间盘内细胞数量减少及功能受损，使得AF的自身修复能力下降，难以

12、维持和修复自身的退变。此外椎间盘内细胞密度低，来源受限，使得通过简单的椎间盘细胞移植来修复AF存在困难。目前主要根据椎间盘退变的程度来决定修复策略，在退变晚期，椎间盘细胞代谢功能严重受损，已经不能够回应任何的生物学刺激，必须借助生物工程学以达到修复的目的。三维培养能够稳定椎间盘细胞的形状和结构，是维持细胞形态和表型所必需的。离心管培养是一种新而简单的培养椎间盘细胞的技术。这种三维培养只需要简单的离心，细胞团内相邻细胞间形成三维接触，有利于细胞外基质的合成6。分泌的细胞外基质使得细胞紧密地结合在一起，形成细胞与细胞间的接触，模拟椎间盘内的环境，有利于细胞团内的细胞维持天然的表型。细胞团在最初的2

13、周内显著长大，3周后趋于稳定，达到最大尺寸。细胞团体积的增大是由于细胞外基质的合成及细胞的增殖，之后体积不再增大与通往细胞团中心的营养通道下降有关。BMMSCs具有以下特点：取材方便且对机体无害；由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题；它可以向多种组织类型分化，在体外可大量培养扩增；转入外源性基因后不影响其特性3。因此，BMMSCs成为骨组织工程理想的种子细胞，在治疗椎间盘退化方面取得了实质性的进展。本研究我们测试BMMSCs是否能够调整AF细胞蛋白多糖和型胶原的合成，是否可用于治疗或延缓椎间盘退变。髓核细胞在椎间盘退变过程中逐渐消失，因此在体内BMMSCs主要作用于AF

14、细胞，而且获得大量有活性的髓核细胞相当困难，从而AF细胞成为修复椎间盘退变的靶向细胞4 。椎间盘细胞与BMMSCs间及其细胞与细胞外基质间的相互作用机制尚不清楚，可能与细胞间缝隙连接及细胞因子等因素有关。Gruber等7证实了AF细胞间存在着缝隙连接，它的存在可以促进细胞的增殖及细胞外基质的分泌。Yamamoto等8证实了共培养模型中TGF-1、IGF- 1、EGF、PDGF等含量明显增高，这些生长因子主要来自于BMMSCs，它们被证明可以促进椎间盘细胞的生长。本研究中的离心管培养模型有利于BMMSCs与AF细胞间细胞因子的传递，有利于缝隙连接的形成，有利于细胞的增殖及细胞外基质的分泌，证明了

15、体外共培养此两种细胞存在着可能性，且细胞团内的细胞维持着分泌细胞外蛋白多糖和型胶原的能力。本研究为进一步探索BMMSCs治疗椎间盘退变的可能性提供了证据。【参考文献】1HOWARD S A,EUGENE J T,MASUDA K.Biological repair of intervertebral discJ.Spine,2003,28(15):S86- S92.2PETER J R.Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of the extracellular matrixJ.Spine,2004

16、,29:2691- 2699.3赵梓汝,吴小涛,祁亚斌,等. TGF-1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究J.中国矫形外科杂志,2006,14(13):1019- 1022.4VISAGE C L,KIM S W,TATENO K,et al.Interaction of human mesenchymal stem cells with disc cells changes in extracellular matrix biosynthesiJ.Spine,2006,31(18):2036- 2042.5PETER J,ROUGHLEY L I,MELCHING T F

17、,et al.The structure and degradation of aggrecan in human intervertebral discJ.Eur Spine J,2006,15 (Suppl 3):S326- S332.6YUNG-LEE J,HALL R,PELINKOVIC D,et al.New use of a three-dimensional pellet culture system for human intervertebral disc cellsJ.Spine,2001,26(21):2316- 2322.7GRUBER H E,MA D F,HANLEY E N,et al.Morphologic and molecular evidence for gap junctions and connexin