外周血淋巴细胞培养及染色体G带标本制备的实验对策

1、外周血淋巴细胞培养及染色体G 带标本制备的实验对策李洁, 徐文瑜, 杨娇英(广东湛江市妇幼保健院, 广东524038摘要:1700例外周血淋巴细胞培养成功率为97%, 8500份G 显带标本制备合格率为94%, 核型分析报告完成率97%。本文对染色体制备技术多个环节:标本采集、接种、培养、低渗、固定、消化、。对40例失败原因及17次违规操作经采取补救措施的效果进行分析评价, 。关键词:外周血淋巴细胞; G 显带; 实验对策中图分类号:R446171文献标识码:B - -0051-02外周血淋巴细胞培养及G 传学研究的基础, , 多环节易受不确定因素干扰的报道多以羊水、, 针对外周血染色体制作方

2、面的报道极少, 本文在15年进行1700例培养, 8500份G 显带处理基础上总结出如下实验对策。资料与方法实验对象:1990年10月2005年8月我院妇儿门诊遗传咨询者及妇产科、新生儿科住院患者1700例。设备与试剂:恒温箱、烤箱、水浴箱、图像分析系统。前1000例培养基为自配, 主要成份:1640粉、小牛血清、PHA 、不含抗生素。后700例培养基为湖南湘雅基因技术有限公司产品。肝素抗凝剂、0. 75%低渗液、0. 4g/ml 秋水仙素、胰酶粉、Gi m esa 染液均为自配。其中抗凝剂, 反复高压4保存。秋水仙素反复冻融-10保存, 胰酶粉(显带前临时配制 4保存, 均可长期多年使用。实

3、验方法:按国内公认的标准方法1, 微量全血培养G 显带。为便于质控, 各操作环节计量恒定:抗凝全血接种5滴(摘下针头培养37、72h秋水仙素阻断0. 4g/ml 4滴(6号针头 离心控制2000r/min ×10m in 低渗液4m l 37水浴15m in 预固定1m l 室温5m in 2次固定4m l 室温5m in 细胞悬液0. 6m l 滴冰片2滴/片×5干燥3720h 烘烤803h 胰酶消化6m in Gi m esa 染片30m in结果与分析培养成功率为97%。本室自定培养合格标准为每例滴片5张, 共有40个以上众相数可供计数。50%的核型(20/40 各条

4、染色体分布舒展, 相对集中、少重叠, 于40×10镜下可明显观察到1号、7号、11号、14号、X, 这6条带纹特征性强的染色体。培养合格可进行下一步显带处理。培养失败40例, 其中2例, 与临床用药和疾病相关38例(见表1 。表1培养失败40例分析(40×10倍总相数/5片显带实验/临床联系n 0纤毛菌阻断时见培养液混浊2<10门诊感染性病例5<30极短A =E 伴新生儿溶血性黄疸5<15引产住院病例17制片成功率为94%(7990/8500 。G 带处理共8500张片。显带合格标准为100×10镜下, 2号、4号、6号、13号、17号、20号、

5、22号共7对染色体的特征性带纹区域可辨认(见表2 。显带合格的核型应15个/5张片。表2室内染色体G 显带合格标准组型号别显带特征描述A 2p1区2带6带p2区2带4带短臂显4条深色带B 4p1区3带5带q3区4带短臂近着丝粒区显1条深色带长臂未端显1条深色带C 6p1区2带q2区4带短臂近着粒区1条深色带中段浅带区较宽D 13p2区1带p3区1带长臂中段深宽带E 17q2区1带q2区4带长臂未端1条深宽带F 20p1区2带短臂上1/2有1细灰带G22q1区1带长臂中段1细灰带17例违规操作采取补救措施后2例失败, 成功率为88.2%见表3。表317例违规操作补救效果观察n违规记录补救措施相数

6、显带3采标本置室温>10h 接种继续实验>40良2低渗后即离心(未固定 重新打散细胞预固定5m in >50良2低渗前误加固定剂离心、弃上清液移管加蒸馏水低渗处理>30合格4培养至91h 进行阻断继续实验>40良2阻断前发现细胞大部分凝固成块加秋水仙时充分振散凝块, 于低渗时弃除伤血块>50合格2烤片温度失控(>100 继续实验>50核型固缩不合格2第一次固定>3h继续实验>10合格(下转第25页15中国优生与遗传杂志2006年第14卷第1 期严重, 被认为是造成各种先天畸形和病残的重要病因之一6, 孕妇只要有HC MV 感染, 就有

7、可能引起严重的胎儿先天感染和新生儿疾病8。孕妇感染HC MV 可发生在妊娠的各个时期, 可以是原发的, 也可以是复发的。孕妇在各个时期感染发生宫内传播的危险率之间虽无差异, 但是以孕早期的感染对胎儿危害最大, 常引起较重的全身感染和先天畸形, 并且母体的原发性感染比复发性感染更易引起宫内传播8, 所以及早发现HC MV 感染具有重要的临床意义, 为临床提供了正确的诊治和处理依据。临床实践证明, 传统培养技术进行病毒分离需要时间长; 而血清学检测抗体则对抗体的要求较高, 且易出现假阴性及假阳性, 即使抗体阳性并不说明病毒是即时感染还是既往感染, 而不能满足临床早期、快速、方法是近年来新兴的一种技

8、术, , 我们就可以应用PCR 而F Q -PCR , 号来检测PCR 产物, , 另一方面还可以做到PCR 每循环一次就收集一个数据, 建立实时扩增曲线, 准确地确定CT 值, 从而根据CT 值确定起始DNA 拷贝数, 做到了真正意义上的DNA 定量。它根据基因扩增量的多少来判断病毒的治疗和预后监测情况, 而且和常规PCR 相比, 它具有特异性强、灵敏度高、定量准确、仪器在线式实时监测、结果直观、避免人为判断, 自动化程度高等特点, 且有效解决了PCR 污染问题。建立HC MV 感染的特异性早期诊断方法是治疗预防该病的前提和关键。F Q -PCR 可应用于HC MV 的早期诊断:许多病原体的

9、抗体产生存在较长的“窗口期”, 不利于疾病的早期诊断, 而此法直接检测病毒DNA, 大大缩短了“窗口期”; 还可用于病情判断和预后评价及药物疗效观察:根据荧光定量PCR 检测直接、反映病原体滴度是否受到药物的治疗而发生变化, 从而为药物疗效观察提供直接依据, 以供临床上对用药剂量、用药时间以及是否联合用药提供参考。HC MV 病毒的早期快速诊断和及时彻底的治疗, 对提高我国人口素质, 优生优育具有十分重要的意义, 随着对我国HC MV 研究的进一步深入, F Q -PCR 的大力推广应用, HC 2MV 感染的会得到及时控制。献1, 方法检测孕妇血中HC MV 感染J .中, 2003, 11

10、(5 :39., 闻良珍. 人巨细胞病毒PP 65蛋白基因的克隆及表达J .中国优生与遗传杂志, 2003, 11(1 :40-42.3Fowler K B, et al . Maternal age and congenital cyt omegal ovirus infec 2ti on:sreening of t w o diverse newborn populati ons 1980-1990J .J I nfect D is, 1993, 168:552.4张厚善, 王守兰, 周妍, 等. 兰州地区早孕妇女、产妇及新生儿中巨细胞病毒感染的研究J .中国优生与遗传杂志, 1998,

11、6(5 :52.5董水绥. 继续深入进行巨细胞病毒感染研究J .中华儿科杂志,1995, 1:3.6肖坤则, 等. 中国围产儿素质现状调查研究J .中华医学杂志,1989, 4:185.7Stagno S, et al . Pri m ary cyt omegal ovirus infecti on in p reganncy . I nci 2dence, trans m issi on t o fetus, and clinical outtcomeJ . JAMA, 1986, 256:1904.收稿日期:2005-05-31(上接第51页讨论本室在公认的标准方法基础上, 对实验全程进行

12、量化恒定, 利于把握, 前后可比。在试剂使用上相对简便。从多次违规操作的补救效果中受到启发, 在必要时推迟阻断时间到91h, 接种不受限, 周四接种可推到周一收获, 方便远路咨询者。此外遇表3操作失误时, 勿轻易中止实验。培养过程污染机率极低。导致培养失败的主要因素是抗生素、消炎药、高胆红素(间接胆红素 的干扰, 可能对淋巴细胞的抑制影响培养质量, 用药近期和新生儿高胆红素血症应暂缓采血培养。防止染色体丢失。离心速度应2000r/min 。稍紧缩的细胞沉淀物可避免操作时碰颤致沉淀物悬浮, 在弃上清液时易丢失少量沉淀物。上世纪70年代有报道标本总量(细胞+试剂 设为4m l 2, 本文认同。实验

13、证明, 4m l 低渗液、固定剂, 对染色体去膜化解旋、舒展、膨胀并无影响。相反, 8m l 细胞悬液与试管, 吸管贴壁面积过大, 在反复多次吸吹过程中丢失部份有效成份。烤片是不容勿视的环节。烤片时间有56过夜或3723d 3, 即刻6080210h 4。本室采取3720h 后803h 。烤片不仅是老化过程, 还可蒸发残留于标本片上固定剂成份, 醇类酸类物质的彻底蒸发, 将利于消化液pH 环境。已报道G 显带技术有7种5, 但以胰酶消化为主。胰酶消化过程短促, 直接影响显带效果的不确定因素有:胰酶的效价、浓度、时间、pH 值3, 因此, 消化过程需灵活控制, 积累经验。本室15年来摸索出一套适应2-4人份/每批量的消化方法:临时配制胰酶液, 用小耳勺挑取少许胰酶粉溶解于0. 85%盐水中, 配制成0. 25%浓度。消化时间为6m in 。小耳勺不需消毒处理, 用蒸馏水冲洗置37干燥。胰酶粉只要保持干燥, 多年不变质, 操作简便, 节省试剂。效果稳定, 适用于基层医院。染色对显带非常重要。Gi m esa 为噻嗪类染料, 其碱性成份天青B 与DNA 分子中的磷酸基结合, 蛋白质在一定的环境中, 具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向, 出现着色差异易于观察。因此染液pH 值对着色效果有影响。当呈淡灰色带纹不显时, 应调节染液pH