实验性左侧精索静脉曲张对青春期大鼠附睾中VEGF、VEGFR

1、实验性左侧精索静脉曲张对青春期大鼠附睾中VEGF、VEGFR2蛋白表达的影响         11-01-09 11:43:00     编辑：studa20          作者：马莉，田宏，张洁，艾庆燕 ，苗乃周，霍涌玮，邱曙东，张秋养【摘要】  目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(VEGFR2)在实验性左侧精索静脉曲张(ELV)大鼠附睾中的表达和定位，探讨

2、VEGF、VEGFR2在精索静脉曲张(VC)致男性不育中的作用。方法 通过部分结扎左肾静脉建立大鼠ELV模型，于术后2周和4周取材，采用免疫组化法检测VEGF、VEGFR2在附睾中的表达变化。结果 ELV大鼠两侧附睾中VEGF蛋白表达均上调，但ELV 4周组表达明显少于2周组；ELV 2周组大鼠附睾中VEGFR2蛋白的表达比对照组有所增加，而ELV4周组相比对照组和ELV 2周组均显著下降。结论 ELV对VEGF、VEGFR2蛋白的表达有影响，说明VC所致男性不育可能与VEGF及VEGFR2的表达变化有关。 【关键词】  血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体2；实验性左侧精索静脉曲

3、张；不育；附睾；免疫组化；大鼠    ABSTRACT: Objective  To study the expression and location of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGFR2 in the epididymis of experimental left varicocele (ELV) rats and explore the effect of both proteins in male infertility caused by varicocele. Meth

4、ods  ELV models of rats were established by partial ligation of the left renal vein. The epididymis was collected at 2 and 4 weeks after the operation. The VEGF and VEGFR2 expression changes were observed by immunohistochemistry. Results  Immunohistochemistry results showed a notable incre

5、ase of VEGF protein expression in 2 and 4week ELV groups compared with that in the corresponding control groups, and VEGF expression in ELV 4 week groups was lower than that in ELV 2week groups. There was a remarkable increase of VEGFR2 protein expression in ELV 2week groups compared with that in th

6、e corresponding control groups. However, in ELV 4week groups, VEGFR2 expression was remarkably decreased compared with that in both control and ELV 2week groups. Conclusion  ELV affects the expression of both VEGF and VEGFR2 in epididymis of rats. It indicates that VEGF and VEGFR2 may play an i

7、mportant role in male infertility caused by varicocele.    KEY WORDS: vascular endothelial growth factor (VEGF); VEGFR2; experimental left varicocele (ELV); infertility; epididymis; immunohistochemistry; rats    精索静脉曲张(varicocele, VC)是引发男性不育的常见原因之一。国外许多学者研究发现，大约30%不育男性患

8、有精索静脉曲张，较国内报道高，说明精索静脉曲张与男性不育有密切的关系。大量临床和实验证明，VC可引起睾丸损伤。由于睾丸产生的精子必须在循附睾头体尾运行的过程中发生形态结构、物质代谢和精子膜的变化才能获得运动和受精能力而达到成熟，因此VC不育患者除睾丸因素外附睾因素无疑也起着重要的作用。但目前关于VC对附睾影响的报道甚少。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)参与了精子的发生和成熟，但国内外均无对其在VC致男性不育的机理方面进行深入研究。本研究在建立实验性左侧精索静脉曲张(experimenta

9、l left varicocele, ELV)动物模型的基础上，采用免疫组化技术检测了VEGF和VEGFR2在ELV病理状态下大鼠附睾中的表达规律和变化情况，探讨ELV对VEGF及VEGFR2表达的影响，为VC不育的机理研究提供实验资料。    1  材料与方法    1.1  动物的分组与模型的建立  选择鼠龄67周、体重180200g的SD雄性大鼠30只(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。将大鼠随机分为ELV 2周组和4周组各10只，另外设假手术2周组和4周组各5只作为对照。200g/L乌拉坦5m

10、L/kg体重腹腔麻醉，部分结扎左肾静脉：腹部正中切口，分离左肾静脉，在左肾上腺静脉和睾丸静脉内侧、下腔静脉外侧置一根直径约为0.5mm的金属杆，与左肾静脉一起结扎，借此使左肾静脉直径缩小约一半，结扎后将金属杆拔出，可见结扎后大鼠左肾静脉迅速扩张，用30丝线缝合切口。假手术组只分离左肾静脉，穿过丝线而不结扎。术后连续3d每日20万单位青霉素腹腔注射。    1.2  主要试剂与动物组织标本的处理  兔抗鼠多克隆VEGF、VEGFR2抗体购于美国Labvision公司；SP9001染色试剂盒与DAB显色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。分别

11、于术后2周及4周取ELV组及对照组双侧附睾组织(以左侧精索静脉比术前扩张2倍以上,且双侧肾脏无明显病变为选取标准)。附睾组织迅速入Bouins液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片5m。    1.3  VEGF、VEGFR2表达的检测  采用SP法进行免疫组化染色：石蜡切片脱蜡至水，在0.01mol/L(pH6.0)枸橼酸缓冲液中微波修复抗原15min后冷却至室温，30mL/L双氧水处理15min消除内源性过氧化物酶，10mL/L TritonX100浸泡15min以增加组织的可穿透性，50mL/L正常羊血清37封闭25min，滴加

12、一抗(1100)，4过夜。恢复室温40min，滴加生物素化二抗，37孵育1h，室温放置40min，加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37孵育25min，DAB显色35 min，终止反应，双蒸水充分洗涤。苏木精复染13min，常规脱水、透明、封片。以上各步骤间均用0.01mol/L(pH 7.07.4)PBS洗2次，每次5min。实验以0.01mol/L(pH 7.07.4)PBS液代替一抗作为阴性对照。以胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，并在Olympus BX51显微镜下拍照。采用Image Pro Plus 5.0软件对每张切片阳性细胞的灰度值进行测定。每张切片随机选取5个视野，计算每个视野

13、阳性细胞的的平均灰度值，比较各组灰度值差异，灰度值越低表示免疫反应阳性越强。    1.4  统计学分析  数值结果以±s表示。应用SPSS 13.0统计软件行单因素方差分析( oneway ANOVA)，检验水准取=0.05。    2  结    果    2.1  VEGF在大鼠附睾中的表达  VEGF蛋白在对照组与实验组大鼠附睾上皮中的表达均表现出细胞特异性和区域特异性。在附睾中，VEGF蛋白几乎表达于附睾管

14、上皮所有主细胞胞质中，呈粗大的阳性颗粒，近管腔游离面的纤毛也呈现阳性染色，亮细胞、晕细胞及基细胞未见阳性染色。VEGF在附睾体部表达最强，头部次之，尾部表达较弱(图1A图1I、1O)。统计结果分析显示，ELV 2周组大鼠左右两侧附睾VEGF蛋白的表达与对照组比较均有显著增强(P均<0.01)，但左、右两侧之间未见明显差异；ELV 4周组大鼠左、右两侧附睾VEGF蛋白的表达与对照组比较均有明显增加(P均<0.01)，左右两侧之间的表达量亦未见有明显差异。ELV4周组分别和ELV 2周组比较，4周组蛋白表达明显少于2周组(P均<0.01，表1)。   

15、; 2.2  VEGFR2在大鼠附睾中的表达  VEGFR2蛋白在对照组与实验组附睾上皮中的表达同样也表现出细胞和区域特异性。在附睾中，VEGFR2阳性染色主要定位于附睾管上皮主细胞胞质，部分间质小血管内皮和毛细血管内皮也呈阳性染色，而亮细胞、基细胞及晕细胞均为阴性。该蛋白在附睾尾部表达最强，头部次之，体部未见阳性表达(图1J图1N、图1P图1R)。ELV 2周组大鼠左、右两侧附睾VEGFR2蛋白的表达与对照组比较均显著增加(P均<0.01)，但左右两侧之间未见有显著差异；ELV 4周组大鼠左、右侧附睾VEGFR2蛋白的表达与对照组比较均有明显下降(P均<0.0

16、1)，左右两侧之间未见有显著差异。ELV 4周组VEGFR2蛋白的表达明显低于2周组(P均<0.01，表1)。     11-01-09 11:43:00     编辑：studa20    3  讨    论    精索静脉曲张(VC)是导致男性不育的重要原因之一，在生殖医学研究领域中引起了广泛的关注，但其发病机制还不甚清楚1。VEGF是目前公认的作用最强的血管通透性因子，它不仅是一个血管内皮细胞特异性有丝分

17、裂原，还是一个强效的血管发生诱导物和血管通透性因子，可诱导内皮细胞分裂与迁移，抑制内皮细胞凋亡2。在很多正常组织中都有VEGF低水平表达，并以受体介导的方式发挥其生物学作用。在已发现的几种VEGF受体中，VEGFR2是最主要的受体之一，是血管发生和构建的主要调节者。研究VEGF、VEGFR2蛋白在ELV大鼠附睾中的表达特点和变化规律，可以进一步为VC不育的发生机理提供实验资料。    ELV大鼠是VC研究的成熟模型34。本研究发现VEGF和VEGFR2蛋白在对照组及ELV大鼠的附睾中都有表达，其表达具有细胞特异性和区域特异性。提示附睾上皮主细胞胞质分泌大量的VEG

18、F蛋白可能通过与自身核上部胞质内的VEGFR2作用，调节其自身的吸收和分泌功能，进而影响附睾管腔液的组成及精子成熟的微环境，参与精子的睾丸后成熟。在附睾中附睾功能的发挥具有明显的区段特异性，多种与精子成熟有关的蛋白质和多肽在附睾的不同区段被分泌。VEGF及VEGFR2在附睾中表达的区域特异性，说明两蛋白不仅参与构建精子附睾内成熟的微环境，共同调节附睾的生理功能，而且各自可能作为特殊物质在精子的成熟过程中发挥不同的作用。    大量临床和实验证明，VC可引起睾丸和附睾的氧化损伤56，在附睾表现为上皮结构受损、管腔上皮细胞表面刷状缘排列紊乱等。这种结构性损伤会导致附睾

19、功能紊乱，改变精子成熟的微环境，因而可能是引起VC不育的一个重要原因。本研究发现，ELV 2周组大鼠两侧附睾中VEGF蛋白表达均上调，但ELV 4周组VEGF蛋白表达明显少于2周组；ELV 2周组大鼠左、右侧附睾中VEGFR2蛋白的表达与对照组比较均稍有增加，而ELV 4周时其表达量比对照组和2周组均显著下降。上述两蛋白在附睾中的表达差异表明ELV对两者表达的影响具有不同步性。ELV早期对附睾中VEGF、VEGFR2的表达产生复杂影响，可能存在多方面的原因，首先是VC所致的附睾组织缺氧和血管发生。有研究证明78，vegf基因5端启动子中有一28bp的增强子片段，内含缺氧诱导因子1(hypoxi

20、a inducing factor1, HIF1)的结合位点。该片段与缺氧时vegf基因转录率增加有关，缺氧可通过增加vegf基因转录率和vegf mRNA稳定性引起vegf基因表达上调，即HIF1刺激了VEGF表达的增强，接着VEGF的增强可以刺激间质细胞睾酮的释放9。由于附睾是雄激素的依赖器官，因而就进一步促进了组织对缺氧的适应性反应。其次，研究表明，在ELV初期附睾血管通透性增加10，甚至有新血管的形成。血管内皮是VEGF的来源之一，新生血管的形成是导致VEGF和VEGFR2表达增多的原因之一，它们可缓解组织淤血缺氧的状况，维持氧的稳态。ELV2周时VEGF的高表达还可能发挥一定的抗凋亡

21、作用，从而保证了精子的成熟。再者，睾酮可正向调节VEGF的表达，ELV初期表现的睾酮合成和分泌增加11，必然会引起VEGF蛋白表达的上升，而VEGF的表达可直接调节其受体的表达，所以ELV2 周时其受体2的表达也随之上升。这种表现在ELV初期的VEGF和VEGFR2的异常表达，提示它们在改善精子成熟的微环境、调控精子的成熟中起着重要作用。ELV对附睾两种蛋白的表达影响呈时间累进性，即4周组蛋白的表达量均较2周组减弱，且对左侧附睾的作用强于右侧。另有研究证明，雄激素水平与ELV 的时程呈负相关12，所以ELV4周时附睾内VEGF及VEGFR2的表达量的减小，可能是ELV后期导致睾酮水平下降所致。

22、    总之，本研究证明了青春期大鼠附睾中有VEGF和VEGFR2的表达，且其表达水平明显受到ELV的影响。VEGF、VEGFR2表达的变化必然对附睾上皮细胞的功能产生影响，进而影响附睾管腔内的微环境以及精子的成熟。间接证明了VC所致的男性不育可能与附睾内VEGF及其受体VEGFR2的改变有关。但其如何影响附睾功能的机理还有待进一步探索。【参考文献】  1俞建军，徐月敏，陈昭典. 精索静脉曲张大鼠睾丸HSP60表达的改变与生精功能损害的相关性 J. 中国计划生育学杂志, 2004, 12(3):147149.2DIAS S, SHMELKOV SV, L

23、AM G, et al. VEGF (165) promotes survival of leukemic cells by HSP90mediated induction of Bcl2 expression and apoptosis inhibition J. Blood, 2002, 99:25322540.3张秋养，邱曙东，马晓年，等. 青春期大鼠实验性精索静脉曲张模型的建立及其对睾丸的影响 J. 西安交通大学学报(医学版), 2002, 23(4):369372.4ZHANG QY, QIU SD, MA XN, et al. Effect of experimental varicocele on structure and function of epididymis in adolescent rats J. Asian J Androl, 2003; 5(2):108112.5夏强，张孝斌，张杰. 精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的实验研究 J. 中华男科学, 2002, 8(6):414415.6张长城，周安方，张茂林，等. 实验性精索静脉曲张对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响 J. 中华男科学, 2003, 9(7):5