斑马鱼卵液中凝菌物质分离纯化及分析

1、斑马鱼卵液中凝菌物质分离纯化及分析 一、实验目的通过生物化学方法，对斑马鱼卵中具有与细菌结合活性的物质进行分离纯化，SDS-PAGE电泳后切胶，对目的蛋白进行进一步质谱分析。2、 实验原理1、 SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而与电荷和分子形状无关。2、 肽指纹图谱测定(Peptide Mass Fingerprinting, PMF) 是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽

2、断进行比较，判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对多种蛋白质组进行了研究。 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离

3、子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。3、 试验材料与试剂1、实验动物 斑马鱼(Danio rerio)购自台东，28于鱼缸中培养，24小时通入无菌空气，每天换水进行养育。 大肠杆菌（E.coli），金黄色葡萄球菌（S.aureus）来自微生物实验室。2、 实验试剂 BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天 P0012 匀浆缓冲液：0.02M Tris-HCl缓冲液 含1

4、00mM NaCl pH=8.0 缓冲液：0.02M Tris-HCl缓冲液 含150mM NaCl 10mM CaCl2 pH=8.0 缓冲液：0.02M Tris-HCl缓冲液含4M尿素 pH=8.0 LB培养基：1000ml去离子水 10g胰化蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl pH=7.0 15psi高压下蒸汽灭菌20min4、 实验步骤1、斑马鱼卵的获得及卵液制备 将亲鱼公、母分开饲喂23天（相互之间能够看到）。喂养时，照明14h黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料。采卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄2：1的比例放入交配缸内，28恒温过夜，次日68时拔出隔板，获得受精卵

5、。 将受精卵收集起来，用匀浆缓冲液将卵冲洗干净，用枪吸取多余水分。用研磨棒将卵捣碎，4 15000g 离心30min，取上清，即为卵液。2、 两种细菌（G+和G-）的培养准备以及菌浓度测定 将E.coli(G-)和S.aureus（G+）分别接种到LB培养基中。37培养6h，将菌液室温3000g离心5min，弃去上清，收集菌体。用0.02M Tris-HCl缓冲液重悬菌体，然后3000g离心5min，共洗涤3次，最后用100ul缓冲液重悬菌体。红细胞计数板法测定菌浓度。3、菌卵孵育，脱洗，超滤浓缩 向上述两种菌体悬液中加入100ul卵液，混匀后，室温温和摇动3h，其中对照组用缓冲液代替卵液，以

6、相同条件进行孵育。孵育后，将菌液与卵液/缓冲液的混合物3000g离心5min，收集菌体后用0.02M Tris-HCl缓冲液重悬菌体，洗涤3次。用100ul缓冲液重悬菌体，室温摇动1h，洗下菌上结合的蛋白。室温下3000g离心5min，取上清进行蛋白质超滤浓缩，并用BCA法测定蛋白质浓度。4、SDS-PAGE电泳及分析 配制12%SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入SDS电极缓冲液。 取40ul样品，加入loading10ul，沸水浴8min。按一定顺序在加样孔中加入样品。 打开电源将电压调到120v，待样品跑过压缩胶后调到200v至样品电泳到胶底部。 取下凝胶，加入染色液，摇床30

7、min。待条带清晰后，加入脱色液过夜。 在灯箱下观察。拍照，分析。5、 实验结果12%的SDS-PAGE:与阴性对照组相比，在两种菌的实验组中116kd/116-66.2kd/35-25kd处均出现了明显的三条带。对大肠杆菌做进一步分析：大肠杆菌数目（个/ml）1.4625*109卵液蛋白浓度（mg/ml）6.6092实验组（E+）蛋白浓度（mg/ml）2.7255对照组（E-）蛋白浓度（mg/ml）3.046110%的SDS-PAGE： 将116kd处的蛋白样品切胶，送往华大基因进行质谱和肽指纹图谱鉴定。6、 分析和讨论 如图所见，斑马鱼卵液（稀释10倍）中含有多种蛋白质，其中有许多母源性免

8、疫因子,如IgM、溶菌酶、凝集素和补体C3等。其对斑马鱼受精卵在充满大量微生物的体外环境中发育，抵抗微生物感染而起到了重要的免疫保护作用。与阴性对照组相比，在实验组中116kd/116-66.2kd/35-25kd处出现了明显的三条带。将116kd处的蛋白样品切胶，送往华大基因进行质谱和肽指纹图谱鉴定。由于分析周期较长，结果尚未出来。有资料表明，二龄草鱼能与WAL兔抗血清反应,产生特异性条带,分子量约为25000；甘露糖结合凝集素(MBL)基因片段作为探针,与二龄草鱼和45月龄草鱼mRNA杂交，表达丰度较高。同时，另有资料表明，MBL分子量大约在30kd左右，猜测斑马鱼卵中具有与细菌结合能力的物质中可能有凝集素类物质。质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。由于质谱法所具有的这些特点使它成为解决生命科学中分析研究的强有力手段，在未知蛋白检测方面具有广泛的应用。例如：Johnston一Wilson等联合运用2D PAGE与质谱技术在精神分裂症、抑郁症、双相障碍