【学习】第六章_一般毒性作用及其试验与评价方法

1、整理课件NoImage第一节第一节 急性毒性作用及其试验与评价急性毒性作用及其试验与评价 第二节亚慢性毒性作用及其试验与评价方第二节亚慢性毒性作用及其试验与评价方法法第三节第三节 蓄积毒性作用及其试验与评价蓄积毒性作用及其试验与评价 第四节第四节 慢性毒性作用及其试验与评价慢性毒性作用及其试验与评价整理课件NoImage外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应称为一般毒性作用。一般毒性作用。 一般毒性作用根据接触毒物的时间长短又可分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。 整理课件NoImage整理课件NoImage一、急性毒性的概念一、

2、急性毒性的概念 二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的 三、急性毒性试验方法的要点三、急性毒性试验方法的要点 四、急性毒性分级和评价四、急性毒性分级和评价 整理课件NoImage一、急性毒性的概念一、急性毒性的概念 急性毒性是指机体（实验动物或人）一次或急性毒性是指机体（实验动物或人）一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。以及死亡效应。 整理课件NoImage1、急性接触的次数、急性接触的次数 （一次或多次）（一次或多次） 24h内内

3、2、中毒效应出现的时间、中毒效应出现的时间（一般为（一般为7-28d） 急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。较短时间内观察到的毒性症状。 3、中毒效应的强度、中毒效应的强度急性毒性概念中的几个问题整理课件NoImage1、测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒、测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，通常以性参数，通常以LD50为最主要的参数；为最主要的参数； 2、初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危反应（效应）关系和对人体产生

4、损害的危险性；险性； 3、研究受试物在动物体内的动力学变化规律；、研究受试物在动物体内的动力学变化规律；4、为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理、为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。 二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的整理课件NoImage包括实验动物、染毒途径、染毒剂包括实验动物、染毒途径、染毒剂量、观察周期、观察指标的选择、量、观察周期、观察指标的选择、计算方法和评价等。计算方法和评价等。 一般来说，一个新化学物在研制初一般来说，一个新化学物在研制初期就要进行急性毒性试验。期就要进行急性毒性试验。 如

5、果急性毒性试验通不过，则后面如果急性毒性试验通不过，则后面的所有试验都不必进行了。的所有试验都不必进行了。整理课件NoImage（一）实验动物的选择和要求（一）实验动物的选择和要求 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物；尽量选择急性毒性反应与人近似的动物； 易于饲养管理、试验操作方便的动物；易于饲养管理、试验操作方便的动物； 繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应；繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应； 价格较低，易于获得的动物。价格较低，易于获得的动物。 实验动物的选择包括物种和品系、年龄、体重、实验动物的选择包括物种和品系、年龄、体重、数量等方面，必须按照其规范要求进行。数量等方面，必须按照其

6、规范要求进行。整理课件NoImage1、实验动物的物种和品系、实验动物的物种和品系 急性毒性试验一般首先选择哺乳动物，急性毒性试验一般首先选择哺乳动物，选择两种或两种以上的动物。包括啮齿选择两种或两种以上的动物。包括啮齿类和非啮齿类。啮齿类以大鼠、小鼠为类和非啮齿类。啮齿类以大鼠、小鼠为最常用。非啮齿类以犬或猴最常用。最常用。非啮齿类以犬或猴最常用。 急性毒性试验所用大鼠的品系以急性毒性试验所用大鼠的品系以Sprague-Dawley（SD）、）、Wistar为主，为主，小鼠则以昆明种、小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多。为多。整理课件整理课件昆明种小鼠昆明种小鼠（KM小鼠）小鼠）特特 点：体

7、型小，产仔多，生点：体型小，产仔多，生长繁殖快，饲养管理方便，长繁殖快，饲养管理方便，对环境的适应性和对疾病的对环境的适应性和对疾病的抵抗力强。广泛应用于药理抵抗力强。广泛应用于药理毒力病理和细菌学研究，以毒力病理和细菌学研究，以及生物制品和药品的鉴定。及生物制品和药品的鉴定。NIH小鼠小鼠特特 点：体型小，产仔多，生点：体型小，产仔多，生长繁殖快，饲养管理方便，对长繁殖快，饲养管理方便，对环境的适应性和对疾病的抵抗环境的适应性和对疾病的抵抗力强。广泛应用于药理毒力病力强。广泛应用于药理毒力病理和细菌学研究，以及生物制理和细菌学研究，以及生物制品和药品的鉴定。品和药品的鉴定。整理课件Wista

8、r大鼠大鼠特特 点：点： 抗病力强，自抗病力强，自发性肿瘤发病率低，发性肿瘤发病率低，多用于肿瘤、免疫、多用于肿瘤、免疫、 药理、内分泌。药理、内分泌。 SD大鼠大鼠特点特点 ：白色，产仔多，：白色，产仔多，生长发育较生长发育较Wistar大大鼠快，对疾病的抵抗鼠快，对疾病的抵抗力较强，尤以对呼吸力较强，尤以对呼吸道疾病的抵抗力强。道疾病的抵抗力强。整理课件NoImage2、实验动物的年龄和体重、实验动物的年龄和体重 通常要求刚成年的动物，且为健通常要求刚成年的动物，且为健康未受孕的动物。康未受孕的动物。 通常大鼠通常大鼠180240g、小鼠、小鼠1825g、家兔、家兔22.5kg、豚鼠、豚鼠

9、200250g、Beagle犬犬46kg、杂种犬、杂种犬815kg。（一）实验动物的选择和要求（一）实验动物的选择和要求整理课件NoImage3、实验动物的性别、实验动物的性别 通常要求为雌雄各半。通常要求为雌雄各半。 但如有资料或预试验发现试验品但如有资料或预试验发现试验品对雌、雄动物毒效应有明显的性对雌、雄动物毒效应有明显的性别差异，则应单独分别试验并求别差异，则应单独分别试验并求出雌性和雄性动物各自的出雌性和雄性动物各自的LD50值。值。整理课件NoImage4、实验动物的预检、实验动物的预检 应先进行动物的给药前检疫观察。应先进行动物的给药前检疫观察。 大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为大

10、鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周，犬、周，犬、猴等适当地延长至猴等适当地延长至23周。周。 设定检疫期有两个主要目的：设定检疫期有两个主要目的： 一是让外购来的实验动物要适应一段时间，减一是让外购来的实验动物要适应一段时间，减少环境和生理条件变化对试验结果的影响；少环境和生理条件变化对试验结果的影响； 二是筛检健康等不符合试验要求的动物二是筛检健康等不符合试验要求的动物 整理课件NoImage5、实验动物的给药前禁食处理、实验动物的给药前禁食处理 采用经口途径染毒，实验动物胃肠采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试

11、验可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作禁食处理。给药前应作禁食处理。 大鼠在前一天傍晚下班时或晚间将大鼠在前一天傍晚下班时或晚间将饲料撤掉。饲料撤掉。 小鼠由于其消化吸收和代谢速度较小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食快，可隔夜禁食也可禁食4h以上。以上。整理课件NoImage 恒定的温度：恒定的温度：223湿度：湿度：3070%光照度：昼夜各半光照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格饲料合格、饮水合格、垫料合格整理课件NoImage不同的不同的LD50计算方法对动物组数的计算方法对动物组数的要求有所不同，一般为要求有所不同，一般为57组。组。 大、小鼠等小动物每组数量

12、通常为大、小鼠等小动物每组数量通常为不少于不少于10只，家兔每组不少于只，家兔每组不少于8只，只，犬等大动物每组不少于犬等大动物每组不少于6只。只。严格按照随机分组进行。严格按照随机分组进行。（二）实验动物分组与数量（二）实验动物分组与数量 整理课件NoImage受试物的接受、分样、保管、称量、配制以及受试物的接受、分样、保管、称量、配制以及在此过程中严格的质量保证是急性毒性试验成在此过程中严格的质量保证是急性毒性试验成功与否的重要环节。功与否的重要环节。 受试物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性受试物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性质特别是挥发性、溶解性等均需了解。质特别是挥发性、溶解性等

13、均需了解。 计算试验所需受试物的总量，一次备齐全部实计算试验所需受试物的总量，一次备齐全部实验的用量。应以同一批号为宜。验的用量。应以同一批号为宜。整理课件NoImage一般推荐，染毒最大量为：一般推荐，染毒最大量为： 经口经口20ml/kg（对空腹动物）；（对空腹动物）； 经皮经皮2ml/kg（根据体表面积计算，限于染毒的（根据体表面积计算，限于染毒的准确性）；准确性）； 静脉静脉1ml/kg（5min以上）；以上）； 肌内注射肌内注射0.5ml/kg（一个部位）；（一个部位）； 每眼每眼0.01ml； 直肠直肠0.5ml/kg； 吸入吸入2mg/L； 鼻：猴或犬每鼻孔鼻：猴或犬每鼻孔0.1

14、ml。整理课件NoImage染毒途径（染毒途径（exposure routes）的选择需考虑：）的选择需考虑：1. 模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式途径和方式；2. 有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较； 3. 受试物的性质和用途；受试物的性质和用途；4. 各种受试物毒性评价程序的要求等。各种受试物毒性评价程序的要求等。（五）染毒方法（五）染毒方法整理课件NoImage 最常用的染毒途径为最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经口、经呼吸道、经皮及注射途径。经皮及注射途径。 吸收速率依次排列，一般是静

15、脉注射吸吸收速率依次排列，一般是静脉注射吸入肌内注射腹腔注射皮下注射经入肌内注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射经皮。口皮内注射经皮。整理课件NoImage1、经口（胃肠道）染毒、经口（胃肠道）染毒 灌胃灌胃 喂饲喂饲 吞咽胶囊吞咽胶囊 整理课件NoImage2、经呼吸道染毒、经呼吸道染毒 研究生产条件下以气体、蒸气、粉研究生产条件下以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形式存在于车间空气尘、烟、雾等形式存在于车间空气中的工业毒物，评价环境空气污染中的工业毒物，评价环境空气污染物，以吸入为给药途径的药物，常物，以吸入为给药途径的药物，常常采用经呼吸道染毒的途径。常采用经呼吸道染毒的途径。整理课件NoImag

16、e3、经皮肤染毒、经皮肤染毒 经皮肤染毒的方式：先使用化学经皮肤染毒的方式：先使用化学法脱毛（常用脱毛剂为硫化钡加法脱毛（常用脱毛剂为硫化钡加滑石粉滑石粉1：4或硫化钠加淀粉或硫化钠加淀粉1：4）或机械法脱毛（剪剃去毛），将或机械法脱毛（剪剃去毛），将动物脊柱两侧背毛脱去，去毛面动物脊柱两侧背毛脱去，去毛面积常为体表面积的积常为体表面积的10。 局部涂敷受试物并以玻璃纸覆盖局部涂敷受试物并以玻璃纸覆盖固定一定时间接触染毒。固定一定时间接触染毒。整理课件NoImage4、经注射途径染毒、经注射途径染毒 对注射药品或需作比较毒性观察对注射药品或需作比较毒性观察的药品进行急性毒性试验时，须的药品进行

17、急性毒性试验时，须作经注射途径染毒。作经注射途径染毒。 注射途径可分为静脉注射或滴注、注射途径可分为静脉注射或滴注、腹腔注射腹腔注射(ip)、肌内注射、肌内注射(im)、皮下注射皮下注射(sc)、皮内注射、皮内注射(id)、椎、椎管内注射等。管内注射等。整理课件NoImage查阅文献查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。确定使用哪一

18、种计算方法求确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用改良寇氏法、概率单位法、霍恩氏法的计算方法常用改良寇氏法、概率单位法、霍恩氏法等。等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。值作为受试化学物的预期毒性中值。 整理课件NoImage一般来说，化学结构和性质比较近似的毒一般来说，化学结构和性质比较近似的毒物，毒性也比较

19、近似。通过以上资料从而物，毒性也比较近似。通过以上资料从而对受试物毒力做出估计，以预期毒性剂量对受试物毒力做出估计，以预期毒性剂量设计预实验方案。设计预实验方案。每个剂量组间的组距可大些，以便寻找出每个剂量组间的组距可大些，以便寻找出受试物的致死剂量范围。受试物的致死剂量范围。整理课件目的是找出目的是找出0及及100估计致死量。更确估计致死量。更确切地说是找到一个切地说是找到一个0死亡的最大剂量和死亡的最大剂量和100死亡的最小剂量的估值以决定实验中采死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量用的最大剂量(Dm)和最小剂量和最小剂量(Dn)，这在，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。测定

20、中非常重要，是实验成败的关键。预试验预试验整理课件NoImage预试验预试验设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计并在该剂量的上下各设计l2个剂量组作为预试验剂个剂量组作为预试验剂量；量；根据确定的剂量组进行染毒；根据确定的剂量组进行染毒；根据预试验的死亡资料确定组距。根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：或： i=(lgLD100-lgLD0)(n-1)公式中公式中i为组距为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差相邻的两个剂量

21、组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。为设计的剂量组数。整理课件一般来说、根据试验设计所选用的一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确计算方法来确定组数。例如寇氏法、几率单位法一般设定组数。例如寇氏法、几率单位法一般设610个剂个剂量组；霍恩法固定设量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得个剂量组。求得i值后，以最低值后，以最低剂量组剂量组(LD0或或LD10)的对数剂量加上一个的对数剂量加上一个i值，即是第值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。123

22、456LgLD0LgLD0+iLgLD0+2i LgLD0+3iLgLD0+4i正式试验正式试验整理课件NoImage对未知毒性的化学物，估计毒性较低时，预试验也对未知毒性的化学物，估计毒性较低时，预试验也可以可以5g/kg剂量进行摸索，来决定是否需正式求剂量进行摸索，来决定是否需正式求LD50。一般来说，化学物。一般来说，化学物LD50如大于如大于5g/kg已表明已表明毒性不大。毒性不大。 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡，方可不进一步试验求高浓度给予动物后未见死亡，方可不进一步试验求出出LD50值。值。 急性毒

23、性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照组，根据需要确定。溶剂对照组，根据需要确定。整理课件NoImage急性毒性试验一般是以死亡为主要记录内容。急性毒性试验一般是以死亡为主要记录内容。除此之外还要注意：除此之外还要注意： 中毒体征及发生过程；中毒体征及发生过程； 死亡情况和时间分布；死亡情况和时间分布； 体重体重 病理形态学变化。病理形态学变化。整理课件NoImage1、中毒体征及发生过程、中毒体征及发生过程 应详细观察和记录动物出现的中毒体征、应详细观察和记录动物出现的中毒体征、发生时间和体征发展的经过。发生时间和体征发展的经过。 机体对毒

24、物作用的反应可以表现出各个机体对毒物作用的反应可以表现出各个系统的特征。系统的特征。整理课件NoImage整理课件NoImage2、死亡情况和时间分布、死亡情况和时间分布 急性毒性试验中实验动物的死亡数是计算急性毒性试验中实验动物的死亡数是计算LD50值的依据，动物死亡数量每增加或减少值的依据，动物死亡数量每增加或减少一只都会对一只都会对LD50值产生明显影响，因此应认值产生明显影响，因此应认真观察和记录。真观察和记录。 分析中毒死亡时间的分布规律，也可以提供分析中毒死亡时间的分布规律，也可以提供重要信息。重要信息。 整理课件NoImage3、体重、体重 实验动物体重变化指标，可以反映动物中毒

25、后实验动物体重变化指标，可以反映动物中毒后综合性整体变化，是一个比较客观简便的量化综合性整体变化，是一个比较客观简便的量化指标。指标。 因此在观察实验动物中毒体征的同时，对存活因此在观察实验动物中毒体征的同时，对存活动物应定期多次称量动物的体重变化，一般为动物应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周每周1次或次或2次。次。整理课件NoImage体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。对存活动物尤其是对低于对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物。剂量组的存活动物。应在观察期应在观察期28天内称量其体重的变化天内称量其体重的变化,以便了解受以便了解受试物引起毒效

26、应的持续时间。试物引起毒效应的持续时间。整理课件NoImage4、病理检查、病理检查 对死亡动物应及时进行大体解剖，肉眼观察大体对死亡动物应及时进行大体解剖，肉眼观察大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变，如有改变须取无充血、出血、水肿或其他改变，如有改变须取材作组织病理学检查。材作组织病理学检查。 对存活动物在观察期结束时亦应进行解剖检查，对存活动物在观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查。必要时做组织病理学检查。整理课件NoImage高剂量组动物染毒后常在数分钟或数十分钟高剂量组动物染毒后常在数分钟

27、或数十分钟内出现死亡，染毒以后应即刻开始观察动物内出现死亡，染毒以后应即刻开始观察动物的中毒表现和死亡情况。的中毒表现和死亡情况。 给药当天应连续或多次观察，以后可根据情给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天况，每天2次或多次观察直到试验周期结束。次或多次观察直到试验周期结束。 急性毒性试验观察周期一般为急性毒性试验观察周期一般为7-28天天。整理课件NoImage改良寇氏法（改良寇氏法（Karber）霍恩氏法（霍恩氏法（Horn）威尔氏法（威尔氏法（Weil）概率单位法概率单位法其他计算方法其他计算方法（九）（九）LD50的计算方法的计算方法整理课件NoImagel l 整理课件No

28、Imagel l 整理课件NoImage整理课件NoImage整理课件NoImageLD50标志着一个化合物毒性的大小，所以常用作急性毒性分级。毒性大小于LD50值成反比，LD50越小，毒性越大，反之，毒性越小。除了LD50以外，还应当报告LD50 95%可信限范围、急性毒作用带等指标，并尽可能详尽描述中毒特征、症状表现、出现时间、死亡前兆、毒性作用的发生、发展、恢复经过，以及体重、剖检和病理学变化等。从而全面的对急性毒性做出评价。整理课件NoImage五、经典急性毒性试验的局限性五、经典急性毒性试验的局限性50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的

29、是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。整理课件NoImage一、基本概念一、基本概念二、试验目的二、试验目的 三、亚慢性毒性试验设计及其评价三、亚慢性毒性试验设计及其评价第二节第二节 亚慢性毒性作用及其试验与亚慢性毒性作用及其试验与评价方法评价方法整理课件NoImage 亚慢性毒性作用是指试验动物连续多日接亚慢性毒性作用是指试验动物连续多日接触较大剂量的外来化学物所出现的中毒效应。触较大剂量的外来化学物所出现的中毒效应。 试验染毒期限应为试验染毒期限应为36个月，或一般为实个月，或一般为实验动物生命期的验动物生命期的1/101/30。 如用小鼠，试验期通常为如用小鼠，试验期

30、通常为3个月，大鼠个月，大鼠36个月，狗个月，狗412个月。个月。 整理课件NoImage（1）进一步探索受试物的毒作用特点和靶器官；）进一步探索受试物的毒作用特点和靶器官；（2）了解受试物有无蓄积作用，是否产生耐受性；）了解受试物有无蓄积作用，是否产生耐受性；（3）分析受试物的剂量）分析受试物的剂量-效应关系；效应关系；（4）初步估计不出现毒性作用的最大耐受剂量）初步估计不出现毒性作用的最大耐受剂量（NOEL或或NOAEL）和出现毒性的最小有作用剂量）和出现毒性的最小有作用剂量（MED）；）；（5）为慢性毒性试验的剂量设计和观察指标提供依据；）为慢性毒性试验的剂量设计和观察指标提供依据；（6

31、）为受试物的毒理机制提供基础资料。）为受试物的毒理机制提供基础资料。整理课件NoImage在遗传毒理学及一些前期的试验难以做出明确评在遗传毒理学及一些前期的试验难以做出明确评价时需要进行亚慢性毒性试验。价时需要进行亚慢性毒性试验。 根据前期的试验结果来设计亚慢性毒性试验，其根据前期的试验结果来设计亚慢性毒性试验，其试验的周期从几个月到一年不等。试验的周期从几个月到一年不等。 在整个亚慢性试验期间，动物均应摄食试验饲料。在整个亚慢性试验期间，动物均应摄食试验饲料。受试物可掺入饲料中，也可掺入饮水中。不得巳受试物可掺入饲料中，也可掺入饮水中。不得巳时可采用灌胃法进行。时可采用灌胃法进行。整理课件N

32、oImage1、实验动物的选择、实验动物的选择 （l）物种和品系）物种和品系 一般要求两种实验动物，一种是啮齿类，一种是非一般要求两种实验动物，一种是啮齿类，一种是非啮齿类，以便全面地了解受试物的毒性。啮齿类，以便全面地了解受试物的毒性。 基本上均使用大鼠和犬，有时用猴，这取决于受试基本上均使用大鼠和犬，有时用猴，这取决于受试物的重要性和试验条件。亚慢性经皮毒性试验，可物的重要性和试验条件。亚慢性经皮毒性试验，可用兔或豚鼠。用兔或豚鼠。 大鼠常用大鼠常用Wistar和和Sprague-Dawley。 犬的亚慢性毒性试验多使用犬的亚慢性毒性试验多使用Beagle犬。犬。整理课件整理课件NoIma

33、ge（2）性别、年龄和动物数）性别、年龄和动物数 性别：一般每组雌雄各半；性别：一般每组雌雄各半； 年龄：刚断乳不就得动物年龄：刚断乳不就得动物大鼠大鼠68周龄（体重周龄（体重80100g） 动物数：大鼠、小鼠每组不少于动物数：大鼠、小鼠每组不少于20只；只； 犬、猴每组不少于犬、猴每组不少于6只。只。整理课件NoImage（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境：）微生物学寄生虫学等级和饲养环境： 亚慢性毒性试验周期较长，观察指标较多，实验动亚慢性毒性试验周期较长，观察指标较多，实验动物的质量、喂饲条件和试验环境明显影响受试物的物的质量、喂饲条件和试验环境明显影响受试物的毒性反应。毒性反应。 实

34、验动物分四级：普通级、清洁级、无特定病原体实验动物分四级：普通级、清洁级、无特定病原体级（级（SPF级）、无菌级。级）、无菌级。 犬和猴分为普通级和犬和猴分为普通级和SPF两级。两级。 亚慢性毒性试验，应使用清洁级及以上等级大小鼠，亚慢性毒性试验，应使用清洁级及以上等级大小鼠，并饲养在屏障环境内进行试验。并饲养在屏障环境内进行试验。整理课件NoImage2、染毒方式、染毒方式 一是应当尽量选择和人类接触途径相似的方式；一是应当尽量选择和人类接触途径相似的方式； 二是应当与预期进行的慢性毒作用研究的接触途径二是应当与预期进行的慢性毒作用研究的接触途径相一致。相一致。 一般以经口、经呼吸道和经皮染

35、毒为多。一般以经口、经呼吸道和经皮染毒为多。 染毒频率通常每日一次，连续给予，如试验期为染毒频率通常每日一次，连续给予，如试验期为3个月或超过个月或超过3个月时，也可每周个月时，也可每周6次。次。整理课件NoImage3、染毒途径、染毒途径 （l）经口染毒：灌胃法、喂饲法、胶囊法。）经口染毒：灌胃法、喂饲法、胶囊法。 （2）经呼吸道染毒：）经呼吸道染毒： （3）注射：）注射： （4）特殊途径：）特殊途径： （5）在进行亚慢性毒性试验时，最好结合进行）在进行亚慢性毒性试验时，最好结合进行毒代动力学血药浓度的监测。毒代动力学血药浓度的监测。整理课件NoImage4、剂量选择和分组、剂量选择和分组

36、一般至少应设一般至少应设3个剂量组和个剂量组和1个阴性（溶剂）对照个阴性（溶剂）对照组。组。阴性对照组阴性对照组低剂量组低剂量组中剂量组中剂量组高剂量组高剂量组组距：组距：310倍，最低不小于倍，最低不小于2倍倍整理课件高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于亡（少于10%）。）。低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（作用剂量（NOAEL）。）。高低剂量组间设置高低剂量组间设置1个中剂量组，比较理想的个中剂量组，比较理想的中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量中剂量组约相当于观察到有害作用的最

37、低剂量（LOAEL）。）。整理课件NoImage原则是，尽量控制在受试动物在整个试验期既不原则是，尽量控制在受试动物在整个试验期既不发生死亡，又有明显毒性反应。发生死亡，又有明显毒性反应。 各组剂量设计的依据：各组剂量设计的依据： 高剂量组：以急性毒性的阈剂量作为亚慢性高剂量组：以急性毒性的阈剂量作为亚慢性毒性试验的最高剂量。毒性试验的最高剂量。 或以该受试物或以该受试物LD50的的1/201/5作为最高剂量作为最高剂量 一般在一般在LD50的的1/101/50之间按等比级数设计之间按等比级数设计其它各组。其它各组。整理课件4. 观察指标1234整理课件整理课件（1）一般性指标）一般性指标包括

38、每日采食量、体重变化（定期称量）、包括每日采食量、体重变化（定期称量）、外观特征（被毛光泽、精神状态、呼吸动作、外观特征（被毛光泽、精神状态、呼吸动作、分泌物、排泄物、饮食、活动、行为等）、分泌物、排泄物、饮食、活动、行为等）、异常表现和中毒症状等。异常表现和中毒症状等。整理课件（2）实验室检查：）实验室检查：NoImagel）血液学检查）血液学检查 2）血液生化检查）血液生化检查 通常为通常为血清血清天门冬氨酸氨基转移酶（天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨）、丙氨酸氨基转移酶（酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（）、碱性磷酸酶（ALP）、尿）、尿素氮（素氮（BUN）、总蛋白（）、总蛋白（T

39、P）、清蛋白（）、清蛋白（ALB）、）、血糖（血糖（GLU）、总胆红素（）、总胆红素（T-BIL）、肌酐）、肌酐（Crea）、总胆固醇（）、总胆固醇（T-CHO）等。）等。 尿液尿液检查包括外观、检查包括外观、pH值、蛋白、糖、潜血和沉值、蛋白、糖、潜血和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息。间代谢产物的信息。整理课件NoImage（3）系统尸解和组织病理学检查）系统尸解和组织病理学检查l）脏器重量和脏器系数：一般称取心、肝、脾、）脏器重量和脏器系数：一般称取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、卵巢或睾丸、脑等脏器湿重，肺、肾、肾上

40、腺、卵巢或睾丸、脑等脏器湿重，并计算其脏器系数。并计算其脏器系数。 2）病理学检查：目的是确定化学毒物对机体毒作）病理学检查：目的是确定化学毒物对机体毒作用的靶部位、损害的性质和程度。用的靶部位、损害的性质和程度。 病理学检查包括：大体检查、常规组织病理学检病理学检查包括：大体检查、常规组织病理学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查等，超微结构检查等，整理课件NoImage分子生物学和分子免疫学手段可应用于测分子生物学和分子免疫学手段可应用于测定许多具有毒理学意义的指标。定许多具有毒理学意义的指标。活性氧增加、细胞凋亡、免疫功能异常

41、活性氧增加、细胞凋亡、免疫功能异常选择相关指标进行测定，有利于探讨有害选择相关指标进行测定，有利于探讨有害作用的机理和对安全性的评价。作用的机理和对安全性的评价。整理课件NoImage（5）分析剂量）分析剂量-效应关系效应关系生物体产生的某种效应只有与其接触的化学物剂量之间呈现相关关系，才能确定此种效应是该接触物引起的。否则，可能另有原因。对于进一步的毒理学试验观察指标的选择和毒理机制的研究具有一定的指导意义。整理课件NoImage心电图、血压、眼底检测；心电图、血压、眼底检测； 对神经系统有影响，可进行神经行为、神经反对神经系统有影响，可进行神经行为、神经反射等检查；射等检查； 对电解质、微

42、量元素代谢有毒作用，则检测血对电解质、微量元素代谢有毒作用，则检测血钙、血磷等含量；钙、血磷等含量； 还可增加眼科、骨髓象检查等。还可增加眼科、骨髓象检查等。整理课件NoImage亚慢性毒性作用评价：亚慢性毒性作用评价： 如某物质的亚慢性毒性无作用剂量小于或等于人如某物质的亚慢性毒性无作用剂量小于或等于人的可能摄入量的的可能摄入量的100倍，则表示毒性很强，应放倍，则表示毒性很强，应放弃该化学物的使用：弃该化学物的使用： 在在100300倍之间者，可进行慢性毒性试验；倍之间者，可进行慢性毒性试验； 若大于或等于若大于或等于300倍者则不必进行慢性试验，可倍者则不必进行慢性试验，可直接进行毒性评

43、价。直接进行毒性评价。整理课件第三节第三节 蓄积毒性作用蓄积毒性作用 一、蓄积毒性作用的基本概念一、蓄积毒性作用的基本概念 二、蓄积作用的研究方法二、蓄积作用的研究方法 整理课件一、基本概念一、基本概念 多次间隔给予小剂量受试物，多次间隔给予小剂量受试物，当给予受试物的时间间隔和剂量当给予受试物的时间间隔和剂量超过机体的解毒和排泄能力时，超过机体的解毒和排泄能力时，导致受试物在体内蓄积，由此引导致受试物在体内蓄积，由此引起的毒性作用称为蓄积性毒性作起的毒性作用称为蓄积性毒性作用。用。整理课件（二）目的：（二）目的： 1. 了解受试物是否具有蓄积作用及蓄积性大小了解受试物是否具有蓄积作用及蓄积性

44、大小如何如何; 2. 评定该化合物是否可引起潜在的慢性毒性危评定该化合物是否可引起潜在的慢性毒性危害害; 3. 为制订该物质在食品中的卫生限量标准时为制订该物质在食品中的卫生限量标准时,安安全系数的选择提供依据。全系数的选择提供依据。 4. 确定该受试物是否可以用于食品供人类长期确定该受试物是否可以用于食品供人类长期食用。食用。整理课件物质蓄积物质蓄积：是指机体少量反复多次接触毒物后，该：是指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内逐渐积累。可以用一定的分析方法检毒物在机体内逐渐积累。可以用一定的分析方法检测出体内该物质或其代谢产物在体内的增加过程，测出体内该物质或其代谢产物在体内的增加过程

45、，这种累计随着时间延长而含量增加，当达到中毒阈这种累计随着时间延长而含量增加，当达到中毒阈值时而产生毒性作用。值时而产生毒性作用。功能蓄积功能蓄积：是指机体少量反复多次接触化学毒物或：是指机体少量反复多次接触化学毒物或其他形式的危害物，每次引起的轻微功能损害逐渐其他形式的危害物，每次引起的轻微功能损害逐渐积累，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时积累，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时用检测手段却查不出体内毒物的的存在或增加。用检测手段却查不出体内毒物的的存在或增加。整理课件蓄积毒性作用产生的因素（1）与接触剂量大小和时间间隔有关）与接触剂量大小和时间间隔有关（2）与毒物本身的性质有关）

46、与毒物本身的性质有关脂溶性物质脂溶性物质 水溶性物质水溶性物质贮存库：如血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、贮存库：如血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等是某些毒物的常见贮存库。肾脏、骨骼等是某些毒物的常见贮存库。（3）与动物种属的代谢特点有关）与动物种属的代谢特点有关整理课件NoImage二、蓄积作用的研究方法二、蓄积作用的研究方法 蓄积毒性作用的研究方法有多种，蓄积毒性作用的研究方法有多种，常用方法有常用方法有蓄积系数法和生物半减期蓄积系数法和生物半减期法法。整理课件NoImage（一）蓄积系数法（一）蓄积系数法 蓄积系数是多次染毒使半数动物蓄积系数是多次染毒使半数动物出现效应（或死亡）的蓄积剂量

47、出现效应（或死亡）的蓄积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂物出现相同效应（或死亡）的剂量量ED50(1)的比值，即：的比值，即：整理课件NoImage在毒理学中研究化学毒物蓄积作用多选在毒理学中研究化学毒物蓄积作用多选择动物来进行，以择动物来进行，以动物死亡一半动物死亡一半为效应为效应指标，那么上式可改写为：指标，那么上式可改写为： LD50(n) K= LD50(1)整理课件K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大。值越小，表示化学毒物的蓄积性越大。 实验动物对化学毒物发生过敏现象，则可能出现实验动物对化学毒物发生过敏现象，则可能出现K1。随着化学毒

48、物蓄积作用减弱，。随着化学毒物蓄积作用减弱，K值增加，通值增加，通常认为常认为K5，其蓄积毒性极弱。，其蓄积毒性极弱。整理课件NoImage常选用大、小鼠等小型实验动物，染毒途径多常选用大、小鼠等小型实验动物，染毒途径多用经口灌胃或腹腔注射。用经口灌胃或腹腔注射。 先求出某毒物的先求出某毒物的LD50，然后选取相同条件的，然后选取相同条件的40只（或更多）实验动物，随机分为两组：染毒只（或更多）实验动物，随机分为两组：染毒试验组和对照组，每组至少试验组和对照组，每组至少20只，雌雄各半。只，雌雄各半。 在在1/201/5 LD50的范围内选定一个剂量，每日的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量，

49、定时和相同途径对试验组进行染以固定剂量，定时和相同途径对试验组进行染毒，观察记录动物死亡数。毒，观察记录动物死亡数。整理课件NoImage当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量，根据公式验。此时，计算累积总接触剂量，根据公式计算计算K值，然后依上表进行评价。值，然后依上表进行评价。若接触剂量已累积达到若接触剂量已累积达到5个个LD50剂量，也可终剂量，也可终止试验，此时计算出止试验，此时计算出K5。 固定剂量法试验期为固定剂量法试验期为25100天。天。整理课件NoImage2、剂量递增法、剂量递增法 50剂量给予试验组染毒，以

50、剂量给予试验组染毒，以4天为一期，每期增加天为一期，每期增加1.5倍。倍。 504天天 504天天 504天天 依次类推。依次类推。 这一方案试验期最长这一方案试验期最长28天。天。整理课件NoImage在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算即可终止试验，计算K值进行评价。值进行评价。 50，即，即K5。 整理课件NoImage该法是基于蓄积系数的原理而设计的。它该法是基于蓄积系数的原理而设计的。它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为分为5个组，包括个组，包括阴性对照组和阴性对照组和1/

51、20LD50、l/10LD50、l/5LD50和和1/2LD50四个剂量组，四个剂量组，每组动物数每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。死亡动物数量。整理课件NoImage试验结束时根据下列标准进行评定：试验结束时根据下列标准进行评定： 1/20LD50组有死亡，且各组呈剂量组有死亡，且各组呈剂量-反应关系，则反应关系，则为强蓄积性；为强蓄积性； 1/20LD50组无死亡，且各组呈剂量组无死亡，且各组呈剂量-反应关系，则反应关系，则为中等蓄积性；为中等蓄积性； 1/20LD50组无死亡

52、，各组也不呈剂量组无死亡，各组也不呈剂量-反应关系，反应关系，则为无明显蓄积性；则为无明显蓄积性；如仅如仅1/2LD50组有死亡，其他组均无死亡，则为弱组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性。蓄积性。整理课件NoImage（二）生物半减期法（二）生物半减期法 生物半减期生物半减期(Biological Half-life, BL, T1/2)，指化，指化学物质进入体内以后，在体内每减少一半所需的学物质进入体内以后，在体内每减少一半所需的时间。对同一化合物在同一种动物体内是一恒值。时间。对同一化合物在同一种动物体内是一恒值。 生物半减期法（生物半减期法（t1/2）是用毒物动力学原理描）是用毒物动

53、力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。述化学毒物在机体内的蓄积作用。 化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。 整理课件NoImage一般来说，一般来说，tl/2较短的化学毒物达到蓄积极限所需较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。长者达到蓄积极限的时间也长。 一种化学毒物若以一种化学毒物若以tl/2相等的时间间距染毒，其在相等的时间间距染毒，其在体内经过体内经过6个个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的接触期就可以基本上达到

54、蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限的的极限，此时理论蓄积量达到极限的98.4。此。此后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上也不会增加。也不会增加。整理课件NoImage蓄积过程蓄积过程: 第一个第一个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L50% 第二个第二个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L75% 第三个第三个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L87.5% 第四个第四个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L93.75% 第五个第五个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L96.88% 第六个第六个BL(T1/2)末蓄积量末蓄积量=L98.44% 一般经过

55、一般经过6个生物半减期个生物半减期 即可达蓄积极限值即可达蓄积极限值整理课件NoImage根据根据tl/2=0.693Ke，通过动物血浆中化学毒物浓度求，通过动物血浆中化学毒物浓度求得得tl/2。 蓄积极限值蓄积极限值1/244at.1AA蓄积极限值（蓄积极限值（mg）a 单位时间内毒物的吸收量（单位时间内毒物的吸收量（mg/d）T1/2生物半减期（生物半减期（d）应用：应用：可根据一个化合物的可根据一个化合物的t1/2值，计算出它在人体内达到的值，计算出它在人体内达到的A值，并可计算出达到值所需的时间值，并可计算出达到值所需的时间整理课件NoImage常用的动物为小鼠或大鼠，首先将受试动物分

56、成蓄积试验组和对照组两大组，每组动物数6070只。蓄积性试验组动物每次以一定剂量（低于最小致死量）按同一染毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测定蓄积性试验组和对照组的LD50，并按下列公式计算蓄积率。蓄积率=蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积组给予受试物的总剂量蓄积率应标明预先给予受试物的时间及剂量。在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大表示该物质在体内的蓄积作用越强；反之，蓄积性则越弱。蓄积组给予受试物的总剂量对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量100%对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50蓄积组给予受试物

57、的总剂量对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50100%蓄积组给予受试物的总剂量对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量100%对照组对照组LD50-蓄积组蓄积组LD50蓄积组给予受试物的总剂量整理课件一、慢性毒性的概念一、慢性毒性的概念 二、慢性毒性试验的目的二、慢性毒性试验的目的 三、慢性毒性试验方法要点三、慢性毒性试验方法要点 四、慢性毒件试验的注意事项四、慢性毒件试验的注意事项第四节第四节 慢性毒性试验设计慢性毒性试验设计 整理课件NoImage一、慢性毒性的概念一、慢性毒性的概念 是指实验动

58、物或人长期（甚至终生）反复接触外源化是指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。学物所产生的毒性效应。 所谓所谓“长期长期”，一般是指，一般是指2年。年。 对大鼠相当于终生染毒，对兔相当于生命期的对大鼠相当于终生染毒，对兔相当于生命期的36%，对犬为对犬为20%，对猴为，对猴为13。对于有些远期毒性评价，。对于有些远期毒性评价，试验期要求达到试验期要求达到710年，甚至在有些动物上要包括若年，甚至在有些动物上要包括若干代试验。干代试验。整理课件NoImage1、研究慢性毒性剂量、研究慢性毒性剂量-反应（效应）关系。反应（效应）关系。 确定长期接触造成有害作用的最低剂量（确定长期接触造成有害作用的最低剂量（LOAEL)或阈剂量和未造成有害作用的剂量（或阈剂量和未造成有害作用的剂量（NOAEL)；2、为制定外来化学物质在食品中的安全限量，如、为制定外来化学物质在食品中的安全限量，如人体人体ADI值，最高残留限量值，最高残留限量MRL值，以及为危险值，以及为危险度评价与管理提供毒理学依据；度评价与管理提供毒理学依据；3、观察慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶、观察慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官，为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供器官，为毒性机制研究和将毒性结果外推